生物学和机械学方法协同解决质子治疗的缺陷(二)：FLASH与微型束
质子治疗相对于光子放疗既有优势也有缺陷。在质子治疗的临床实践中，其主要的局限如下：射程不确定性、横向半影、靶区外沉积高线性能量传递(LET)射线，入射前端表面剂量、射束路径上的剂量、临近靶区危及器官的剂量限值、器官运动以及治疗费用等。
西班牙基隆萨洛德质子中心(Centro de Protonterapia Quironsalud)的研究人员回顾和提出了一些生物学和机械学方面的解决建议，以期能够减轻质子治疗的缺陷，用特定的方法来分配剂量的空间分布(微型束，minibeams)和时间分布(FLASH效应)，降低系统复杂性(旋转治疗)和成本(无旋转机架方法)，使质子治疗更可以造福更多的癌症患者。上一期与大家分享了《生物学和机械学方法协同解决质子治疗的缺陷：(一)：质子治疗的优势与缺陷分析》，本期为大家带来生物学方法中的FLASH治疗与微型束放疗。原文发表在Frontiers in Oncology杂志。联系质子中国小编(微信号：ProntonCN)获取全文。
生物学：重新探究放射生物学，提升对正常组织的保护
肿瘤的位置和射线治疗的性质不可避免地会对周围正常组织造成一定程度的不良影响。质子微型束放疗(Proton minibeam radiation therapy, pMBRT)和超高剂量率(FLASH)治疗是两种创新的放射治疗方式，其潜在的降低正常组织毒性反应的特性已经被研究证实，相对于标准的放射治疗，它们可能会在放疗领域引起新的变革。
最近的临床前治疗研究发现，名为“FLASH”的新方法，即在1个微秒的短脉冲时间内或低于100~500毫秒的时间内递送5~10戈瑞的单次剂量，该方法能够在保持对肿瘤杀伤效果的同时，显著减少对正常组织的损伤。这种FLASH治疗模式早在上世纪70年代就在肠道肿瘤和皮肤肿瘤领域的治疗方面提出过。其中的一位先驱者J. Hendry，早在七八十年代就指出在高强度脉冲电子束作用下，组织的辐射防护与氧含量有关。这种理论最近在FLASH临床治疗的潜能方面又重新被热议起来，最终成为支持研究者继续发展质子FLASH实验并且进行长时间随访以便更好的理解其中的治疗参数及效应的一大因素。FLASH治疗效应的稳健性最近在各种动物模型上得到了证实，如老鼠、大鼠、斑马鱼、猪和猫等，用于肺、皮肤、肠道和大脑等器官的实验也得到了验证。
为了证明FLASH治疗对组织器官有着更低的辐射损伤效应，法国居里研究所的Favaudon教授等人使用小鼠肺纤维化模型，证明与常规剂量率(0.03 Gy/s)相比，采用FLASH剂量率(40~60 Gy/s)对小鼠胸部进行照射，可减少肺纤维化的发生率，而常规剂量率模式下放射性肺纤维化发生率达100%。在这项研究中，研究人员还使用了头颈部鳞状癌的异种移植模型、乳腺癌的异种移植模型和肺癌的同系移植模型，发现这三种模型下FLASH治疗模式在抑制肿瘤生长方面与常规剂量率放疗一样有效。详情请见质子中国往期报道《居里研究所：质子栅极治疗与FLASH质子治疗的前世今生》。
对小鼠腹部的FLASH照射也证明该模式能有效降低放疗毒性反应。在最近的一项研究中，美国宾夕法尼亚大学的研究人员发现，在对10周龄C57BL/6J小鼠进行15 Gy的全腹部FLASH质子治疗(789 Gy/s)或标准质子(0.9 0.08 Gy/s)照射后，进行FLASH照射的小鼠急性细胞损失和晚期纤维化都相对减少，而对肿瘤生长的影响两种照射方式相似。这与之前在肠道中观察到的FLASH 放疗保护作用的研究结论一致。美国马里兰大学的研究人员与瓦里安医疗的科研人员也使用质子束报道了在小鼠胸部区域给与15 Gy以上剂量照射的FLASH(以及脉冲束FLASH)模式同“传统”模式之间的放射性效应的差异，研究人员使用如下几个观察终点，体重、皮肤炎症、肺功能、肺纤维化以及性别化差异(母性小鼠有更好的FLASH反应但细胞死亡率模型上并无差异)。详情请见质子中国往期报道《质子FLASH治疗：杀伤肿瘤同时更好的保护正常组织》、《首例应用临床设备的Flash治疗临床前研究结果公布，可更好保护健康组织和器官》。
此外，研究也表明常规放疗相比，FLASH治疗引起的神经毒性反应更少。瑞士洛桑大学医院的研究报道，用FLASH 模式照射全脑的小鼠比接受常规放疗的小鼠有着更好的记忆保护以及更好的学习能力。
FLASH治疗能够降低组织毒性反应的生物学机制尚未得到充分理解。与常规剂量率的放疗相比，FLASH降低了对正常组织和/或肿瘤组织的长期毒性反应，可以用不同类型和/或诱导的DNA损伤量来解释。体外实验表明，FLASH诱导的基因组不稳定性要比常规剂量率放疗低得多。
除了DNA损伤之外，人们还提出了一些假说来解释FLASH效应，比如自由基的存在或氧的消耗会根据细胞的状态和新陈代谢触发不同的生物反应。氧耗竭已被提出可引起短暂缺氧和放射抵抗，这被认为是FLASH的潜在机制，但目前仍缺乏体外数据来支持这一假设。
为了测试氧气在FLASH效应中的作用，瑞典隆德大学的研究人员在不同的氧气浓度下用600 Gy/s(FLASH)或14 Gy/min(常规对照)照射前列腺癌细胞。结果显示，在缺氧条件下，FLASH照射的细胞存活率增加，而在常氧条件下，FLASH照射和常规照射之间没有差异。瑞士洛桑大学医院最近的一项研究提出，超高剂量率下的氧消耗会抑制活性氧(ROS)的产生，而活性氧会促进放射抵抗，研究结果显示，增加局部氧气浓度会降低FLASH的保护作用。
此外，使用活性氧清除剂去除活性氧可使斑马鱼胚胎对常规放疗敏感，而在FLASH治疗中没有效果。氧耗竭假说被用来解释正常组织对FLASH的放射抵抗。除了局部和瞬态氧消耗，自由基-自由基相互作用是FLASH效应的另一个假设原因。FLASH照射能够导致高浓度的局部自由基可与DNA相互作用。
如果肿瘤(或者肿瘤的部分体积)是部分，而非全部缺氧，它们如何同FLASH放疗相互作用？肿瘤细胞中常见的代谢重组或适当抗氧化防御机制的缺失，可能会加速辐射诱导的自由基的存在，从而危害肿瘤细胞的生存能力。目前仍然需要更多的研究来验证这些假设的实验，以充分理解FLASH治疗所诱导的生物学效应。
研究结果也认为免疫系统和炎症反应也在FLASH放疗对正常组织的保护作用中发挥作用。法国居里研究所的Favaudon教授等人发现，在FLASH照射的小鼠中，转化生长因子(TGFb)的诱导发生了变化，而TGFb是一种促炎信号。此外，先前的研究显示在接受FLASH照射的肿瘤中T淋巴细胞的招募有所增加。在最近的一项研究中，研究人员对用FLASH或常规放疗照射的小鼠进行了全基因组微阵列分析，结果显示FLASH 照射后小鼠免疫系统的发生了全面激活和成熟下调。因此，这些研究表明FLASH照射诱导被照射组织的免疫系统反应；然而，这种反应背后的分子机制仍有待解释。
最近，英国Wardman教授回顾了60年来脉冲放射分解的经验，并强调了对正常细胞和组织细胞分化作用的两种机制，即对反应至关重要的化学物质的消耗和自由基-自由基反应。法国居里研究所的Favaudon教授也回顾了这两种方法，即氧耗竭和自由基重组，并且对第二种现象给了更高的权重；研究人员还指出，在缺氧(或深度缺氧)和高氧的两种极端情况下，都没有FLASH效应，因此了解肿瘤和组织中的氧压以预测这种效应非常重要。该小组提出了一个支持过氧自由基重组作为主要效应的化学动力学模型，并加入了法国居里研究所Fouillade教授等人的结果。他们得出结论，肿瘤和健康组织之间的差异部分可能与DNA损伤(依赖于氧和自由基)和双链断裂修复蛋白53BP1有关，肿瘤细胞有修复缺陷。
从已发表的数据中可以得出以下结论，解释FLASH效应的主要假设基于三个主要方面：(a)氧浓度的“窗口”；(b)自由基动力学；(c)肿瘤细胞和健康细胞之间的内在分化与其DNA损伤修复机制有关。正确认识FLASH效应背后的机制，有助于建立旨在保护肿瘤周围的健康组织，减少电离辐射有害影响的方案，同时保持放疗对肿瘤组织的杀伤效果。第一个临床应用已经报道，新的临床试验正在批准。此外，FLASH在儿童中的潜在应用(例如，用于髓母细胞瘤)已被引用于对幼年小鼠的研究中。详情请见质子中国往期报道《全球首例临床试验患者接受FLASH质子治疗》。
微型束放疗(MBRT)是使用一系列非常窄(亚毫米)的平行微型束形成剂量分布的空间分次放疗方法。该方法产生了由峰谷模式组成的剂量剖面。
微型束放疗并非新提出来的，先前有使用光子的“网格(GRID)”放疗方法，使用大的峰和谷或区模式，束斑均在1厘米范围内，采用正电压装置来避免引起皮肤毒性反应，通常是用Co-60和直线加速器来缩小晚期和姑息性病例的恶性肿瘤，但不具有治疗目的。
微型束放疗的原理是，束流的尺寸越小，健康组织的剂量耐受性似乎就越高，这使得该方法仍然可以达到治疗的目的。这种现象被称作剂量体积效应(dose-volume effect)。已有研究报道，MBRT的神经毒性小于标准放疗。研究微型束放疗技术的应用前景是使用X射线微型束对大鼠脑部肿瘤进行照射。法国国家卫生与医学研究所(INSERM)的研究人员发现，接受微型束放疗的胶质瘤大鼠的生存时间是未接受治疗大鼠的两倍，与通过其他方式放疗获得的结果相似。然而，在健康大鼠中未发现X射线微型束放射造成的脑损伤，这表明健康组织对亚毫米空间分割束有更高的耐受性。实验表明，X射线微型束可以用于脑部肿瘤放射治疗。
法国国家科学研究中心(CNRS)改造了一种小动物辐照设备，使其能够进行MBRT实验。作为概念实验的证明，研究者对一组大鼠进行标准辐照，另一组大鼠进行MBRT，两组平均剂量均为20 Gy，辐照后6.5个月进行评估。研究发现在标准辐照组大鼠的脑部有扩展损伤出现，而在MBRT组没有观察到明显的脑部损伤。体外实验研究表明MBRT能够诱导人胶质瘤细胞系克隆性细胞死亡。该研究团队最近的一份报告显示，质子MBRT(pMBRT)增加了高级别胶质瘤的治疗窗口。研究发现pMBRT比标准质子治疗产生的神经毒性更小，而且还能显著降低肿瘤的生长。这就为更激进的放疗方案打开了大门。
在法国LRAcc实验室最近的一项研究比较了三种不同MBRT模式的微观和纳米剂量学特征：质子(pMBRT)、光子(xMBRT)和电子(EMBRT)。研究发现pMBRT在保护正常组织方面是最有效的，因为它能减少剂量峰区和谷区细胞核的能量沉积和DNA断裂数量。此外，pMBRT也是肿瘤区域最有效的治疗方法，因为它与细胞核内更多的复杂DNA断裂和更高的能量沉积以及每次质子沉积的能量有关。
如上所述，已有多项研究报道了MBRT在临床前阶段的治疗价值，但迄今为止，上述技术对保护正常组织的生物学机制尚未完全了解。一般来说，MBRT对健康组织的保护作用与正常组织血管系统对MBRT技术有着明显的抵抗有关。此外，有人提出MBRT对肿瘤生长的抑制作用与其对肿瘤血管系统的优先破坏作用有关。当微型束照射在啮齿类动物的大脑时，不会改变血容量或血管密度。事实上，在微型束路径中血管的内皮细胞内衬是完整的。然而，未成熟的血管比成熟的血管对MBRT更敏感。这导致了一种假说，即肿瘤中未成熟的血管对MBRT更敏感，而健康组织中成熟的血管对MBRT有抵抗性。一些报道已经表明MBRT能够影响肿瘤的血管结构，但是所造成的影响程度大小还依赖于肿瘤类型。一般来说，MBRT能够诱导肿瘤血管减少并进而导致灌注减少和肿瘤缺氧。然而，在乳腺肿瘤模型中，MBRT增加了周细胞数量，表明血管结构和肿瘤氧合正常化。虽然MBRT优先影响肿瘤的血管结构，但不应将MBRT的作用仅局限于血管作用。
法国国家卫生与医学研究所(INSERM)一项对正常大鼠脑部和胶质瘤组织在MBRT照射后早期转录组反应的研究表明，炎症和免疫似乎是影响MBRT疗效的主要因素。与自然杀伤细胞 (NK)或CD8+ T淋巴细胞相关的通路在受照组织中的表现尤为明显。此外，研究人员还在受照组织中发现了HMGB1、Toll样受体1、2、7、C型凝集素7A和CD36基因的改变。这些基因可以触发先天或适应性免疫细胞的激活。因此，研究人员的假设是，受照细胞的生化变化激活了上述基因，进而促进炎症或免疫反应。这与澳大利亚莫纳什大学之前通过基因组转录筛选报道的MBRT在小鼠哺乳动物肿瘤中诱导免疫相关基因上调的数据一致。需要对健康组织和/或肿瘤的免疫反应进行更多的体外和体内实验，以更充分地了解MBRT背后的机制。研究人员表示MBRT的作用机制方面仍有许多悬而未决的问题存在。
虽然FLASH和MBRT的作用机制和生物学效应仍在研究中，但这两种放疗模式都有可能成为放疗领域的革新技术。FLASH和MBRT为治愈性放疗打开了新的大门，并可能成为放射抵抗性肿瘤的有效治疗方法。
接下来，小编将为大家带来FLASH与微型束的剂量学问题和时间因素、弧形治疗、无旋转机架治疗等解决质子治疗缺陷的方法，敬请期待。(质子中国 编辑报道)
参考文献：Mazal A, Vera Sanchez JA, Sanchez-Parcerisa D, et al. Biological and Mechanical Synergies to Deal With Proton Therapy Pitfalls: Minibeams, FLASH, Arcs, and Gantryless Rooms. Front Oncol. 2021;10:613669. Published 2021 Jan 21. doi:10.3389/fonc.2020.613669.