单细胞时代 || 宿主-微生物组相互作用

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稳健，潇洒，大方，靠谱。

一段生信缘，一棵技能树。

生信技能树核心成员，单细胞天地特约撰稿人，简书创作者，单细胞数据科学家。

Host-Microbiome Interactions in the Era of Single-Cell Biology

这不是最好的时代，也不是最坏的时代，这里是单细胞时代。灵活的单细胞系统，高效的组织解离液，开源的数据分析工具，端到端的单细胞解决方案是未来发展的趋势。这里最主要的是开放灵活的单细胞系统，有了这个系统我们就可以自主地设计反应体系，来从不同纬度捕获单个细胞的信息。

单细胞不是一个技术而是一个层次，会给此前的生命科学领域带来新的视角。在本文中，我们跟着一篇综述来看看单细胞技术如何为肠道菌群研究带来新的希望。你看，围绕肠道菌群已经开发的单细胞技术有：

• scDual-Seq: mapping the gene regulatory program of Salmonella infection by host and pathogen single-cell RNA-sequencing
• Highly Multiplexed Spatial Mapping of Microbial Communities
• Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing
• MAPS-seq: magnetic bead-assisted parallel single-cell gene expression profiling
• Single-cell genomics of uncultured bacteria reveals dietary fiber responders in the mouse gut microbiota
• Interaction Between the Microbiota, Epithelia, and Immune Cells in the Intestine

微生物是最普遍的生命形式，但是对于微生物的多样性（diversity）我们知道的还很少。近年来，随着测序技术的出现（mNGS,16S,metagenome），人们对它们在调节宿主生理方面的作用有了更深入的认识，微生物已成为人类健康和疾病生物学研究的前沿。正所谓“遇事不决，量子力学；机制难寻，肠道菌群；迁移侵袭，PBMC”。尽管如此，由于核酸和细胞分析方法的出现，捕获微生物及其诱导的宿主反应的异质性（heterogeneity）一直颇具挑战性。通过基因组学、转录组学和空间组学，单细胞分析领域是我们对复杂生物理解的最新技术。这些技术显著地促进了我们对宿主生物学的理解，但只是在最近才应用于微生物研究，阐明了它们的多样性以及在共生和致病背景下与宿主细胞的相互作用。

在这篇综述中，我们回顾新兴技术的应用及其将为理解微生物异质性提供新的见解。然后，我们详细研究了宿主单细胞分析如何揭示微生物对宿主异质性的影响以及宿主生物学对微生物的影响。如果没有单细胞分析的出现，这些见解将是具有挑战性的，在某些情况下是不可能的。这表明了单细胞范式对于微生物学领域向前发展的重要性，通过宿主-微生物组的视角，应用这些见解来更好地理解和治疗人类疾病。

微生物是地球上主要的生命形式，据估计地球上大约有10³⁰个细菌细胞和古菌。最近的一项估计显示，地球上有人居住的微生物物种数量为10¹¹-10¹²种。尽管有巨大的生态多样性和普遍性，微生物仍然是一些最不具特征的生物，可能有超过99%的微生物类群尚待发现。据估计，每个人体内都有10¹³-10¹⁵个微生物细胞，这个数字相当于我们体内的体细胞数量。不可否认，对人体微生物组的更全面了解也会使我们对人类健康和疾病有更深入的了解。事实上，在过去的十年中，许多研究表明微生物组与人类疾病有关，包括炎症性肠病、癌症、中枢神经系统障碍、血管疾病以及肥胖。

在过去的几十年里，研究微生物组的测序和模型技术的进步极大地促进了生物发育和疾病病理中的作用。无菌人源化小鼠作为一种研究模型生物微生物组的方法被广泛采用。同时，在基因组水平上，最常用的鉴定方法包括16S核糖体DNA (rDNA)测序、宏基因组和宏转录组测序、微生物组代谢组学鉴定等，以更好地了解微生物组的组成和菌落水平的特征。

尽管有了以上进展，尽管它在表型可变疾病如IBD的背景下的重要性已经得到了一定的的认识，但对微生物组异质性的理解仍有挑战。特别是，通常使用的方法往往失去了跨菌落和物种内部的微生物的空间和细胞分层。最近在单细胞分离和测序技术的进展提供了一个潜在的解决方案，然而，一些因素阻碍了传统的单细胞测序方法在微生物特性方面的研究。

• 低的DNA和mRNA含量限制了从单个细胞中进行测序分析的合理数量的遗传物质。
• 细菌mRNA缺乏聚腺苷化限制了其与rRNA的分离。
• 此外，细胞壁和细胞膜的多样性对单细胞RNA测序(scRNA-seq)所需的持续裂解或渗透提出了挑战。

一些技术已经开始处理上述的限制。荧光激活细胞分选(FACS)已被应用于未培养的微生物，以实现单细胞分离，然后裂解，全基因组扩增(WGA)，以及基于16SrRNA的细胞鉴定。微流控技术在细胞分离中的应用在微生物学领域迅速发展，实现了对单细胞微生物基因组的高通量分离、片段化和条形码(Lan et al.， 2017)。单滴多位移扩增(Single droplet multiple displacement amplification，sd-MDA)捕获皮升滴中的单个细胞，然后进行全基因组扩增，保持单基因组特异性的完整性。然而，这种方法的一个局限性是MDA会放大DNA污染，产生不均匀的reads覆盖，导致嵌合片段连接不相邻的模板序列(Zhang et al.， 2006)。凝胶微滴培养是一种方法，单细胞捕获琼脂滴，并在MDA之前生长到数百个细胞。虽然这允许从单细胞扩增基因组，但这可能会产生基于琼脂细胞培养要求的采样偏差。

下面，我们将重点介绍一些新兴技术，这些技术用于在单细胞分辨率下更好地描述人类固有的微生物组以及宿主-微生物组关系。这些进步可以被归类为在微生物组细胞水平上的基因组和转录多样性以及在菌落水平上赋予空间分布异质性。

在单细胞分辨率下的微生物组研究

解决分类学和功能的异质性

微生物单细胞基因组学是一个最近和迅速出现的领域。为真核细胞开发的单细胞基因组学的进展，使得同样可以应用于原核生物的工具成为可能。其中一项技术被称为SPLiT-Seq，涉及RNA的组合条形码编码，并在单细胞水平上对细菌转录组学产生了新的见解。在SPLiT-Seq中，细胞是固定的，通透性的，cDNA是由细胞RNA通过细胞内逆转录(RT)生成的，使用条形码poly-T和随机六聚体引物以多孔形式生成。多轮的细胞池和随机分裂，然后是明确的cDNA条形码，确保高可能性的独特标签RNA每个细胞起源。这种技术非常适合于微生物应用，因为它能够绕过单细胞分离，并允许无偏性捕获RNA表达谱。

为了实现mRNA的富集，最近的一项研究利用大肠杆菌聚合酶I (PAP)在细胞中优先富集聚腺苷酸mRNA。这项研究特别应用了分裂池，称为“微分裂”，以识别在一系列应激反应、代谢途径和细菌生长发育中具有不同基因表达模式的各种细菌亚群。通过对大肠杆菌MW1255和枯草芽孢杆菌PY79细胞的热休克暴露分析，确定了管家和应激反应sigma因子的时间激活，并将其组织成细菌群的亚群。进一步的分析揭示了碳利用调控、胁迫响应、金属吸收和发育决策在生长阶段的时间变化，表明亚种群在广泛的途径上存在异质性。此外，另一个关键发现是在合格状态的转录标记富集的后期的细菌。参与微生物相互作用的微生物和宿主细胞的单细胞特性鉴定技术。微生物可以通过多种单细胞基因组学、空间特性和组合空间基因组技术来研究。

微生物分裂池连接转录组(microSPLiT -pool ligation transcriptomics, micro - split)利用多轮细胞池和随机分裂，按细胞来源对cDNA进行唯一的条形码，从而实现对RNA表达谱的无偏捕获，并绕过了单细胞分离的要求(Kuchina et al.， 2019)。

一种类似的使用分裂池测序的技术也被开发出来，称为原核表达谱，通过标记RNA的原位和测序(PETRI-seq)。PETRI-seq由三个主要组件组成:细胞准备、分裂池条形码和建库。microSPLiT协议中的几个显著差异包括缺少优先mRNA捕获和使用AMPure XP beads纯化细胞裂解液中的cDNA时使用链霉亲和素捕获纯化cDNA。PETRI-seq能够通过不同生长阶段对单个大肠杆菌细胞进行强有力的鉴别，发现稳定期相关基因表达、核糖体蛋白表达和氨基酸生物合成的预期趋势。使用PETRI-seq，作者应用主成分分析对6663个金黄色葡萄球菌单细胞转录组进行了检测，能够检测到一个稀有的亚群(0.04%)接受原噬菌体诱导的细胞，富集了SA3usa原噬菌体的裂解基因。

另一项最近应用于微生物分析的技术是单扩增基因组(SAG)测序。SAG测序的一种特殊变体称为SAG-gel，它包括三个步骤：用凝胶珠分离单个细菌细胞，两轮平行的多重置换扩增(MDA)和多重单基因组测序。第一步是通过微流体液滴发生器在琼脂糖溶液中进行单细胞封装。在对含有小滴的单菌进行冷却后，琼脂糖聚合形成小珠，然后将其置于细胞裂解试剂和MDA中。经SYBR绿色染色鉴定为扩增阳性的凝胶珠，然后分选到96孔板中，进行第二轮MDA检测。按照DNA产量和污染的质量控制步骤，进行全基因组测序。

一项研究考察了膳食纤维菊粉对小鼠肠道微生物群组成的影响。利用16S rRNA基因测序初步在家族水平对细菌应答物进行分类，然后将SAG测序应用于小鼠肠道菌群，了解菊粉喂养后增加的特定细菌对菊粉的利用能力。本研究的一个关键发现是利用含有菊粉酶的位点簇鉴定了两个具有多糖反应的拟杆菌基因组。这些基因组与已知菊粉蛋白使用率相似，被认为是B.酸化因子的一个潜在的新亚群。此外，进一步对这两种有应答的拟杆菌进行基因组分析，与无应答的拟杆菌比较，发现其在辅因子和维生素代谢、氨基酸转运和生物合成途径、碳水化合物代谢等保守的生物合成途径存在差异，提示菊糖应答者在小鼠肠道菌群中发挥不同的代谢作用。

为了解决单扩增基因组中存在的偏置基因组覆盖和嵌合序列问题，一项研究开发了一种新的分析流程，称为单细胞扩增基因组的清洗和联合装配(ccSAG)。在ccSAG中，首先根据V3-V4区域的16S rRNA相似性和平均核苷酸的一致性，将原始菌株分组。原始contigs由这些凹陷组成，在组内进行比较，并被分类为干净的、未映射的或潜在的嵌合读区。嵌合体根据原始contigs的对齐情况进行分割并重新映射。交叉引用映射和嵌合体分裂的循环最终识别未映射读并去除嵌合体。最后，将清洁reads重新组装到复合凹陷弧群中，并使用原始复合凹陷弧群进行桥接。这就产生了无间隙的复合单细胞基因组。将此分析方法应用于基于微流体的小鼠肠道微生物的单细胞MDA测序。从这项研究中，拟杆菌菌株内的两个新的草图基因组在代谢途径上存在差异，如钴胺素生物合成，这表明这些新菌株具有不同的代谢作用。值得注意的是，当比较菌株中SAGs的编码序列时，在多糖裂解酶基因中检测到导致氨基酸变化的单核苷酸多态性(SNPs)。由于构建了复合单细胞基因组，传统的SAG联合装配可能忽略了这些snp，而ccSAG的分析方法允许检测菌株内snp，这表明在同一微生物物种中存在比以前认为的更大的遗传和功能异质性。

与流式细胞术和传统microfluidic-based测序技术,虚拟微流体是发达国家，而不是物理微流体隔离单分子和细胞，大量利用聚乙二醇(PEG)水凝胶来实现diffusion-based没有分子或细胞间的离散边界划分。在这种形式下，小分子和寡核苷酸可以在虚拟的“隔间”之间自由移动，而单细胞和高分子量MDA产品则不能。这种格式允许对单个细胞和MDA产品聚类进行简单的物理隔离，以便进行成像、分析和本地化条形码。此外，MDA中间体的局部限制可以解决技术限制，如嵌合读取，提高单细胞MDA产品在更大范围的完整性。利用该技术对混合培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了单细胞散弹猎枪基因组测序，成功解决了单细胞扩增产物，没有交叉污染。在同一项研究中，这项技术被应用于斐济社区微生物组项目(Fiji Community Microbiome Project)的人类粪便样本中不同的、无特征的微生物种类。虚拟微流体识别了一个在霰弹枪数据的标准分类学分配中最初没有检测到的微生物家族。这表明了一种无偏倚的单细胞方法(如虚拟微流体法)对微生物分析的重要性，特别是当特定的生物体可能无法在参考数据集中很好地表示时。

每一种方法的发现都是有关微生物特性的基础发现的例子，否则在Bulk测序中就会遗漏这些特性，这限制了对细胞间变异的检测，而这种变异在允许特定亚种群随着环境变化而出现时通常是至关重要的。获得单细胞基因组分辨率的能力具有重要的临床意义，如细菌持久性和大型微生物群落不可培养成分的特性。此外，这些新技术排除了参考基因组的需要。这使得我们可以分析来自宿主的未培养细菌，其中许多细菌还没有被分类或鉴定，并且开启了对微生物组组成的新见解。

解决空间异质性

基因组测序提供了在单细胞水平上更好地去褶积复杂微生物亚群的优势，但也带来了这样复杂种群所包含的空间信息丢失的缺点。目前建立的视觉成像方法在混合群落中对应变水平的区分提出了挑战。在这方面，一些研究着眼于提供微生物群落的单细胞空间信息。

其中一个例子是一个AT-rich核糖体结合位点(RBS)文库，类似于脆弱拟杆菌(Bf)噬菌体基因上游发现的序列，从中识别出最高表达产生启动子序列，称为PBfP1E6 (Whitaker et al.， 2017)。在拟杆菌中，与常用启动子相比，pbfp1e6驱动的表达显示至少一个数量级的荧光，比16S rRNA启动子高70倍。值得注意的是，该启动子没有检测到降低菌株在体内的适应度。通过突变分析，创建了一系列不同强度的可互换启动子，表达范围达3万倍。六种不同的拟杆菌被设计成基于不同水平的GFP和mCherry表达组合产生独特的荧光特征。这些可以在低细胞识别错误(约6%)的体内被识别。作为这项技术的结果，作者试图检验拟杆菌在小鼠肠道的隐窝（crypt ）定植对随后同种菌株的定植尝试的影响。内腔关联在维持定殖中被认为是重要的，然而，这个特殊的研究允许空间分辨率的等基因菌株定位。值得注意的是，顺序定殖导致第二株菌的整体定殖明显较低，这在内腔相对于管腔处被大大夸大，这进一步证明内腔定殖在肠道内的拟杆菌固结中起着重要作用。这项研究是一个早期的例子，说明如何利用分子工具来提供应变水平的分辨率，以揭示肠道微生物的定植异质性。

荧光原位杂交(FISH)分析的目标是rRNA分类鉴定和可视化目前存在，但在分类分辨率有限。最近发展的基于荧光的检测方法的一种改进是高系统发育分辨率FISH (HiPR-FISH)。该技术通过使用两步过程的二进制条形码系统提供了高多路复用性:第一步利用分类特异的16S rRNA探针，而第二步涉及与一组荧光标记读出探针的杂交。用荧光读出的分类特异的16S rRNA探针的解耦使这项技术的规模扩大到足够多的独特组合，以研究自然中复杂的微生物生态系统。为了实现单细胞定量，作者对现有的单细胞图像自动分割算法进行了改进，该算法在HiPR-FISH后进行了多次像素分类和滤波以进行图像优化。

该方法可对人口腔菌斑微生物组中的微生物种类进行定量物理分析。具体地说，以前未在成像实验中描述的特殊属性细胞的新型微结构——可能是由于它们的低发病率——能够从这项工作中得到赞赏。在小鼠肠道微生物组的应用中，HiPR-FISH图谱被创建用于两种不同抗生素治疗的小鼠和对照组。作者发现抗生素治疗导致小鼠肠道邻近类群的空间组织发生特殊变化，这表明在微生物组分析中除了考虑相对物种丰度外，还考虑相对空间生物地理学的重要性。HiPR-FISH技术的独特优势在于，对多色条形码的实时解码仅需一轮成像，数据采集速度比传统FISH技术更快。此外，多路复用的能力与多轮杂交和成像允许进一步分离的初始读数。

考虑到在基因组和空间水平上都能理解微生物组的新能力，自然的进展是确定如何将这两种关键的信息来源结合在一起，提供微生物组的空间基因组分析。为此，开发了一种通过测序的宏基因组小区取样方法(MaPS-seq)，该方法将微生物细胞保存在其原生生物地理环境中，从而创建微生物组的空间图谱。MaPS-seq首先固定输入的组织样本，然后渗透并与含有反向16S rRNA扩增引物的丙烯酰胺溶液孵卵。然后通过低温珠打裂产生细胞团簇，进行细胞裂解，并通过尼龙网过滤以选择颗粒大小。这些产生的集群包含了以地理方式保存的基因组DNA，使空间信息的捕获成为可能。然后，这些聚类与含有独特条形码的前向16S rRNA扩增引物的凝胶珠共包被，可将凝胶珠光切，以确保在聚合物基质降解时释放基因组DNA。得到的液滴进行PCR扩增，然后进行液滴分离和深度测序。这些测序reads按照独特的条形码进行分组，然后根据细菌操作分类学单位(OTUs)的相对丰度进行分类。

作者应用MaPS -seq研究了小鼠消化道不同区域的肠道微生物群，特别是回肠、盲肠和远端结肠。当比较GI位点时，他们观察到了分类学上的差异，但是也观察到了一些共同的关联，比如在盲肠和结肠中发现了Lachnospiraceae和lactobacillus aceae之间的正相关。这些空间结构表明，尽管环境因素可以可变地塑造微生物区系的局部空间结构，但存在更强的不受环境变化影响的关联。此外，当应用MaPS -seq研究饮食改变后远端结肠微生物群的空间组织时，可以发现低脂、植物多糖为基础的饮食中存在特殊的类群系统发育集群，而在给予高脂、高糖饮食的小鼠中则没有观察到这种亚群。根据t-SNE分析，来自这两种饮食的集群形成了高度不同且重叠有限的群体，这表明在饮食结构的改变中空间组织发生了重大变化。mam-seq分析技术提供了一个新的层次的洞察，在不同宿主环境和环境扰动的背景下，微生物类群的空间组织，这将被传统的方法忽略。

总之，这些研究显示了用单细胞基因组学和空间特性互补是当前可用的宏基因组分析的内在力量。这些分析的结合可能最终使被低估的微生物生物地理学特性得以实现，并阐明宿主微生物群固有的复杂性，以及环境影响对微生物之间的空间关系和基因组变化的实时影响。

在微生物环境下的宿主异质性的单细胞研究

承认微生物群落在分类和功能上的异质性，特别有趣的是检查宿主对微生物挑战的反应的适应程度和变异性。在单细胞水平上对微生物的分析不仅可以提供对微生物组的洞察，而且提供了更好地描述微生物与其宿主之间的细胞间关系的潜力。这是基本的背景生理学和病理生理学，环境对宿主免疫学的影响，以及宿主细胞在调节微生物组的作用。

宿主与共生体的相互作用

对宿主细胞的单细胞分析为共生体和病原微生物在调节宿主生理中的作用提供了新的见解。其中一项研究对无菌(GF)和无特异性病原体(SPF)小鼠的结肠巨噬细胞进行了单细胞RNA测序。在比较SPF小鼠和GF的所有结肠巨噬细胞簇时，发现SPF巨噬细胞与免疫防御、抗原递呈和氧化磷酸化相关的基因表达增加。亚群级别的分析,两个巨噬细胞集群在SPF小鼠表现出明显增加：第一CD11c + CD206intCD121b +，这显示在抗原处理相关基因的表达水平高，脂质本地化和细胞迁移，和第二个群CD11c−CD206hiCD121b−，显示增加interleukin-1基因参与了反应,伤口愈合，脉管系统监管，凋亡细胞间隙，细胞因子的生产。无菌小鼠在巨噬细胞中富集，炎症和应激反应的基因表达降低。这两个簇被发现来自一个共同的高CCR2表达水平的巨噬细胞前体簇。在CD11c+CD206intCD121b+和CD11c−CD206hiCD121b−细胞中，CCR2的丢失和泛巨噬细胞标志物的增加遵循假时间过程。通过对结肠MPs不同亚群的流式细胞术和大量RNA测序分析，验证了这项工作的有效性。因此，应用scRNA-seq在细胞水平上研究宿主细胞已经确定了特定结肠巨噬细胞亚群的产生依赖于宿主肠道内细菌驱动的分化轨迹。

先天性淋巴样细胞(ILC)是最近发现的先天性免疫系统的组成部分，是粘膜免疫、炎症和组织稳态的关键调节剂。根据转录因子的不同表达，辅助型ILCs可以细分为三种不同的类型，这使得ILCs具有不同的特征。为了确定ILCs对微生物组的反应，以及随后微生物组的变化如何改变ILC生物学，一项研究应用scRNA-seq来揭示ILCs在单细胞水平上对微生物定植的反应。antibiotic-treated和GF小鼠小肠粘膜的分析,作者发现了相似的集群antibiotic-treated和GF老鼠,都是大大不同于SPF小鼠,暗示类似的效应ilc的预处理或缩短微生物群损耗。在抗生素处理和GF小鼠中，当比较ILC亚组的相对丰度时，观察到ILC3和ILC2细胞扩增，ILC1表型缺失。在ILC1和ILC2亚群中，观察到ILC2特异性基因的表达急剧下降，同时ilc3特异性基因的表达增加。此外，细胞因子IL-17a的表达，以前被认为是依赖于微生物组的，在抗生素处理和GF小鼠中，在所有亚组中持续丢失，这进一步证明了微生物组对IL-17a表达的影响。最终，将scRNA-seq应用于与微生物组细胞接近的免疫细胞，揭示了身份和细胞命运调节的细胞水平变化，否则在bulk测序中就会丢失这些变化。

宿主与病原体的相互作用

除了共生体，致病性微生物在组成和功能上同样显示出高度的群体内异质性。这就提出了一个问题，即细胞间的差异如何预测或改变病理环境下宿主与微生物的关系。这已经在巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌的研究中被探索，以揭示复杂的，对感染性微生物的异质性免疫反应的潜在机制。近年来，人们对宿主对微生物感染的反应有了更多的了解，这已经成为在单细胞水平阐明宿主免疫-微生物组关系的一个有价值的工具。

由于巨噬细胞对病原微生物表现出不同的反应结果——未感染、病原体破坏感染、病原体持续感染——一项研究对沙门氏菌暴露的小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)进行了scRNA-seq，以区分其转录变化和免疫应答结果。主成分分析显示，暴露和未暴露病原体以及感染和未感染巨噬细胞的基因簇使巨噬细胞分层。然而，在巨噬细胞的一个亚群中诱导了一个富含I型干扰素(IFN)反应的基因簇，发现该基因簇可以区分感染的巨噬细胞和未感染的、病原体暴露的巨噬细胞。在感染的巨噬细胞亚群中，主要对感染细胞内信号反应的基因比那些对细菌表达细胞外信号反应的基因变异更大。这种差异表明，即使在表型上同质的感染细胞群体中，也存在内在的异质性。通过对感染巨噬细胞的进一步研究，我们发现沙门氏菌毒力因子PhoPQ的表达水平决定了感染巨噬细胞中I型IFN的诱导水平。PhoPQ可以上调对巨噬细胞内存活至关重要的基因。在本研究中，单细胞分析是鉴定这样一个群体的关键，因为I型IFN基因簇在平均分布于所有细胞时没有被高度诱导。这项工作强调了致病变异和感染细胞和旁观者细胞的宿主反应异质性的重要性，表明免疫激活状态并不是在宿主的一个筒体中运行，但也反映了病原体的内在变异，这些变异随后导致了宿主的反应。

在本研究的基础上，另一组试图探索巨噬细胞如何对极端的细胞内细菌生长异质性作出反应。通过荧光沙门氏菌菌株报告了小鼠BMMs内的细菌增殖情况，作者结合细胞分选和scRNA-seq鉴定了三个巨噬细胞亚群：初始巨噬细胞和两组受攻击巨噬细胞。通过对这两组受到攻击的巨噬细胞的分析，发现含有非生长细菌的巨噬细胞的表达谱显示了促炎M1极化状态的特征，并与旁观者细胞无法区分，这表明非生长细菌逃避了细胞内免疫受体的识别。相反，含有生长细菌的巨噬细胞呈抗炎的m2样状态，这表明快速生长的沙门氏菌通过重组巨噬细胞的极化来避免宿主的反应。这被发现是感染的直接结果，因为这样的M2标记在原始巨噬细胞中缺失，并被证明与细菌增殖相关。此外，作者还确定了这两种巨噬细胞极端状态之间的一系列中间状态。这项研究证明了最近受到重视的概念，即微生物可以利用宿主基因组的可塑性来实现其自身的维持或增殖的生物学需求。

结合巨噬细胞和原核病原体的测序，另一项研究将scRNA-Seq应用于沙门氏菌感染的巨噬细胞，在单细胞环境下对宿主和病原体进行双重分析，称为scDual-Seq (Avital et al.， 2017)。该方法包括通过随机六聚体DNA寡聚物启动逆转录，使用条形码引物进行多路复用，体外转录进行RNA扩增，以及配对端Illumina测序。reads的片段被映射到老鼠和沙门氏菌的转录组上。通过本研究，作者鉴定了两类具有不同转录特征的细胞内沙门氏菌，分别为I类和II类。

此外，他们发现感染巨噬细胞的三个亚群：部分诱导感染I类沙门氏菌的巨噬细胞，完全诱导感染I类沙门氏菌的巨噬细胞 以及完全诱导感染II类沙门氏菌的巨噬细胞。通过伪时间分析，本研究发现巨噬细胞跟随从部分诱导状态到完全诱导状态的线性进程，同时在沙门氏菌类中发生从I到II的变化。这项研究代表了一种新的范式，通过同时分析两个转录组来研究宿主-病原体的相互作用。尽管表型分解由于感染的多样性而受到限制，未来的工作可以继续建立这种宿主和病原体的关联分析方法。

除了免疫细胞，上皮细胞对病原体的反应也被证明在宿主体内平衡中发挥重要作用。其中一项研究检测了沙门氏菌和多回蠕虫对宿主肠上皮细胞的影响。通过基于液滴的scRNA-seq技术，作者对不同感染时间的小鼠小肠上皮细胞进行了分析。对病原体的反应分为病原体特异性和病原体共享细胞内在的改变和改变肠道细胞组成。在对沙门氏菌的细胞内在反应方面，在所有感染的上皮细胞中，参与细菌防御反应通路的基因表达发生了变化。有趣的是，一些对沙门氏菌的反应被发现是通过细胞类型特异性的方式诱导的，如各种抗菌肽和促炎蛋白。相反，其他先前被认为是细胞类型特异性的蛋白质，如抗微生物肽Reg3a，在沙门氏菌感染后在所有细胞类型中都被发现。在蠕虫感染的反应中，大多数诱导基因是病原体特异性基因，包括炎症反应基因和簇细胞标记。在杯状细胞中，先前与抗寄生虫免疫有关的基因被发现被诱导。值得注意的是，在杯状细胞H. polygyrus反应中发现的一些基因(Wars和Pnlipr2)之前并不知道在这些细胞中表达。H. polygyrus和沙门氏菌感染都导致干细胞中应激基因模块的上调。在细胞组成改变方面，沙门氏菌感染导致成熟肠上皮细胞和Paneth细胞增加，同时转运扩增细胞和干细胞显著减少。多回感染显著增加杯状细胞和簇状细胞计数，同时减少肠上皮细胞。这些结果表明，对宿主对病原体的反应有一个更完整的理解，这涉及到对感染的整体和细胞特异性改变的混合作用。本研究揭示了病原体对宿主上皮细胞的实质性特异性作用，包括许多在没有单细胞方法的情况下未知的发现。

应用我们对宿主-微生物组相互作用的理解，在临床环境中尤其相关，因为患者的结局往往与他们独特的生理和免疫反应相联系。一项研究使用沙门氏菌体外感染人外周血单核细胞(PBMC)模型，对未暴露和暴露的细胞进行scRNA-seq，以揭示感染前后的免疫细胞类型及其亚型。通过这些信息，一种算法被开发，以反卷积体积测量的PBMCs从病原体暴露到细胞类型以及亚群体依赖于病原体暴露。随后，这一方法被应用于来自不同疾病阶段结核病患者群体的大量RNA-seq数据。他的算法能够在基线(出现活动性疾病症状之前)将潜在的结核病感染者分为可能发展为活动性疾病的患者和不会发展为活动性疾病的患者。这代表了宿主细胞在微生物感染背景下的scRNA-seq的惊人能力，因此单核细胞感染的数据，及其相关特征，从一种类型的病原体可以用于和应用于其他病原性疾病。这对于感染性疾病患者的预后和由微生物调节的更广泛的疾病应用具有巨大的临床价值。

对病毒感染的宿主的研究类似于细胞内细菌感染，对参与宿主反应的特定细胞类型和途径有了新的见解。一项研究开发了一种名为“病毒追踪”的计算工具来区分病毒感染宿主细胞和scRNA-seq数据中的病毒RNA。这是通过将scRNA-seq数据全面映射到已知病毒基因组数据库中来实现的。因此，与病毒感染相关的细胞类型可以与未感染的旁观者细胞群分开进行分析。在本研究中，viral - track成功识别了多种体内小鼠感染模型和人类临床乙肝感染样本中的感染细胞，并检测了与病毒复制相关的宿主因子。作者还应用病毒径迹研究了COVID-19中、重度患者的支气管肺泡灌洗样本。该分析揭示了病毒对轻、重症患者免疫细胞的影响差异。轻度患者出现肺泡巨噬细胞富集，重度患者出现中性粒细胞、炎性单核细胞、巨噬细胞和更原始的CD4+ T细胞表型。通过观察炎症信号来区分严重表型:SPP1+单核细胞的炎症趋化因子基因和与缺氧或氧化应激相关的基因上调，而MHC II类和I型IFN基因下调。肺泡巨噬细胞也表现出严重相关的特定趋化因子和组织蛋白酶的上调。通过对病毒感染背景下的宿主细胞的分析，本研究显示了单细胞测序在解剖病毒感染机制方面的广泛适用性，包括病毒诱导病理中的细胞和分子特征。此外，它突出了传统scRNA-seq中未映射到宿主基因组的reads的巨大价值。在临床环境中，病毒跟踪工具是一个例子，说明如何使用scRNA-seq计算管道作为诊断工具，识别病毒疾病中的免疫调节，并识别联合感染。

这些研究确定了宿主和病原体转录组内细胞间变异的新轴，不仅可以用来了解疾病的发病机制，还可以预测疾病的结果(Penaranda和Hung, 2019)。这项工作强调了单细胞分析宿主和微生物细胞的重要性，当特征的组织，器官，或复杂的生物体范围内宿主-微生物关系的表现。

结论

尽管在微生物及其宿主相互作用的单细胞生物学特性方面的技术进展尚不成熟，但该领域出现了几个共同的主题。首先，单个微生物细胞可以通过多种模式进行高分辨率分析(图1A-E)，其中许多模式已经从真核生物应用中调整并优化为微生物使用。因此，人类单细胞生物学的不断进步很可能会继续激发和启发微生物技术。相反，单细胞研究对微生物的独特挑战——低RNA和DNA含量，细胞膜和细胞壁的多样性——挑战并鼓励当前技术提高灵敏度和再现性，这有利于微生物和多细胞生物研究(图1F-H)。

在上述研究中，除了基因组学、转录组学和空间分辨率方面的改进外，现在还出现了能够结合多种分析类型的新方法，这样研究人员就不需要牺牲一种分析类型来进行另一种分析。这些方法也为同时研究宿主和微生物的界面开辟了道路(图1I)。通过对单细胞的研究，在认识共生体在调节宿主生理和细胞分化途径中的作用方面取得了很大进展。通过应用宿主-病原体的相互作用，这些研究揭示了病原体的异质性对宿主疾病状态的影响，宿主对感染的新反应，以及细胞和组织水平上的稳态变化。这些见解可用于识别更为灵敏和准确的临床诊断生物标志物，预测和监测治疗结果，并利用宿主-微生物组的相互作用，以达到有益的目的。

最后，这些技术还需要回答一些新的生物学问题，比如微生物亚群与宿主之间的合作行为如何能够成功地实现从营养吸收到病原体清除的协调结果。此外，在这些反应中，细菌和宿主细胞之间的分工，可能在RNA-seq细胞行为的体积平均值中丢失，现在可以进一步研究。这里所审查的技术将促进今后的研究，旨在澄清该领域若干悬而未决的问题，例如:

• 细菌亚群如何合作以实现种群水平的优势增长?
• 宿主细胞亚群如何协调抗微生物反应，以最大化效率和最小化组织损伤?
• 宿主和微生物方面的细胞亚群参与的层次是什么?

回答这些问题可能会使我们有一种新的思路来思考未来如何根据不同的细胞亚群设计治疗方案。