编译：秦时明月，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
低温是水稻产量和地理分布的限制因素。野生稻是水稻改良的重要种质资源，它对许多非生物胁迫具有良好的耐受性，包括低温胁迫，但人们对其抗寒机制知之甚少。本研究阐明了野生稻耐低温的分子遗传机制，比较分析了两个水稻基因型(冷敏型ce253和耐冷型Y12-4)在低温胁迫下萌发期的综合转录组图谱，共获得42，446，871万个reads，结果显示ce253和Y12-4基因型分别有29,128和30,131个差异基因。对冷敏感和耐冷基因型中的许多共同和差异表达基因(DEG)进行了分析，结果表明，在低温胁迫的四个时期，耐冷基因型的DEG上调幅度均大于冷敏感基因型。基于细胞过程、代谢过程、反应刺激、膜部分和催化活性的GO富集分析表明，耐冷基因型比冷敏感基因型上调的基因多于下调的基因。对随机选择的7个DEG进行qRT-PCR分析，以验证RNA测序数据。这些基因表现出与RNA-Seq方法相对应的表达模式。加权基因共表达网络分析(WGCNA)表明，Y12-4在低温胁迫下比ce253有更多的高表达基因。本研究还探究了编码UDP-葡萄糖基转移酶的耐冷基因LTG5的功能，发现LTG5基因的过表达赋予籼稻耐冷性。对野生稻中与冷胁迫相关的基因资源的研究对提高作物的耐冷性有一定的参考价值。
原名：Transcriptomic profiling of germinating seeds under cold stress and characterization of the cold-tolerant gene LTG5 in rice
译名：低温胁迫下水稻萌发种子的转录组分析及耐冷基因LTG5的鉴定
期刊：BMC Plant Biology
IF：3.497
发表时间：2020.08
通讯作者：邓国富
通讯作者单位：广西农业科学院
DOI号：10.1186/s12870-020-02569-z
本研究选用冷敏籼稻品种ce253和耐寒的普通野生稻(O.rufipogon Griff.) Y12-4做为供试材料。在4°C下分别于0、3、6、12和24小时取样的三天龄种子和相应的0、3、6、12和24小时取样的水稻进行RNA-Seq及qRT-PCR分析，对转录组数据进行差异表达基因分析、GO富集分析、加权基因共表达分析等。然后对鉴定到的耐冷候选基因LTG5进行表达模式分析与亚细胞定位，并构建超表达株系验证其功能。1 冷敏感籼稻ce253与耐冷野生稻Y12-4在低温胁迫下的表型差异本研究选用冷敏籼稻ce253和耐冷野生稻Y12-4，在低温胁迫下，处理胚芽鞘长度≥5 mm的种子，发现ce253和Y12-4的存活率有显著差异(图1)，Y12-4的恢复能力优于253。4°C处理10d，恢复5d后(图1)，Y12-4的发芽率为76%，ce253的发芽率为0%。
图1 对照和冷处理ce253和Y12-4发芽率的比较。A. ce253和Y12-4在25°C下处理7d；B. ce253和Y12-4在4°C下处理10d并恢复5d；C. ce253和Y12-4在正常和低温处理下的发芽率。低温在整体转录组水平上诱导了不同类型水稻的基因表达(图2A)，表明低温诱导了广泛的转录激活。此外，主成分分析揭示了ce253和Y12-4之间参与冷诱导反应的基因网络的不同(图2B)。RNA-Seq结果显示，在相同的低温条件下，ce253在3、6、12和24小时后在稻芽中发现DEGs，而Y12-4在3、6、12和24小时后在稻芽中发现DEGs，分别为2310(第1373个上调/937个下调)、4309个(1694个上调/2615个下调)、7677个(2576个上调/5101个下调)和11,296个(3266个上调/8030个下调)(图3)(图4)。在第3、6、12和24h，耐冷性的Y12-4比冷敏感的ce253上调的基因更多，而在3h后，Y12-4的下调的基因比其他时期的上调的基因要少。结果表明，Y12-4对冷胁迫有较多的基因表达上调，低温处理影响了基因表达的整体格局。在低温胁迫下，ce253和Y12-4分别显示了1128和1401个差异表达的转录本(图4A和B)。为了鉴定基因表达模式，研究人员对两个水稻品系在0、3、6、12和24小时的DEG进行了系统聚类(图5)。ce253和Y12-4对早期冷胁迫的复杂转录反应模式可以通过系统聚类进行可视化。热图分析表明，除了冷处理后上调和下调的基因数量显著增加外，ce253和Y12-4之间的表达率与对照相比也发生了很大的变化(图5)。长期(24小时)冷胁迫增加了调控基因的数量。在两个品种中都没有几个基因支持这一基本机制，但在ce253和Y12-4中有几个不同的基因对冷胁迫有反应。
图4 低温下两个水稻基因型差异表达基因的Venn图谱。A. ce253基因型中不同冷应答基因表达的Venn图谱。B. Y12-4基因型不同冷应答基因表达的Venn图谱。
图5冷处理下两个水稻品系DEGs的系统聚类图。A. ce253基因型不同冷应答基因表达模式的热图。B. Y12-4基因型不同冷应答基因表达模式的热图3 共表达网络分析在冷胁迫相关DEGs鉴定中的应用为了寻找水稻低温处理相关基因，研究人员对所有基因进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)。分析确定了ce253 中的18个WGCNA模块和Y12-4中的14个WGGNA模块(图6A和B)。两个模块的P值和色阶显示出模块之间的相关性。模块的基因特征值反映了模块在样本中的综合表达水平。在ce253和Y12-4的棕色模块中分别发现3970和5829个基因。此外，在两个棕色模块中发现了1962个基因。这些途径共包含218个基因，包括氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢、环境适应、折叠、分选和降解、翻译、信号转导、膜转运、核苷酸代谢和脂类代谢。3个模块与冷胁迫呈正相关(黄色、绿黄色和粉红色)，表明这些模块中的基因正向调节Y12-4的冷胁迫(图6C)。7个模块与冷胁迫呈负相关(蓝色、棕色、红色、品红、浅橙色、绿色和黑色)，表明这些模块中的基因在Y12-4(图6C)中负调控冷胁迫。4个模块与冷胁迫呈正相关(棕色、深蓝、品红和紫色)，表明这些模块中的基因正向调节ce253的冷胁迫(图6D)。12个模数与冷胁迫呈负相关(青色、棕色、粉色、绿黄色、淡黄色、亮青色、红色、黑色、蓝色、亮绿色、绿色和浅橙色)。在亮绿模块中，冷胁迫24h基因表达水平上调，0、3、6、12h基因表达水平下调，ce253基因型比Y12-4表现出更多的负相关，Y12-4的正相关比ce253多。结果表明，Y12-4是一个耐冷品种。在本研究中，研究人员将COLD1、CTB4a、LTG1、CTB1、ICE1基因归入蓝色模组，qLTG3-1基因归入棕色模组，CBF1和CBF3基因归入Y12-4中的紫色模块。但是，在Y12-4的所有模块中都没有LTT7。冷处理涉及到这四个模块：蓝色、棕色、紫色和绿黄色模块。KEGG分析表明，常见的富集代谢途径是“对刺激的反应”和“信号”。蓝色、棕色、紫色和绿黄色模块中的基因对冷胁迫相关的代谢物和植物激素有贡献。CBF2是一种重要的转录因子，调节下游基因对冷胁迫的反应(图6E)。
图6 ce253和Y12-4冷胁迫后DEG的加权基因共表达网络分析(WGCNA)。使用GO搜索比较每个数据集的富集类别，以比较两个基因型的萌发种子的转录本(图7)。所有的基因被归类为三个主要的GO类别：生物过程、细胞组成和分子功能。34个GO分类被差异富集。在Y12-4-0h和Y12-4-3h的耐冷数据集中富集的大多数GO分类都显示了上调的基因 (图7)。通过BlastX搜索，对照4个公共数据库(NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG)，将注释分配给每个转录本和基因，其中36个基因在0h对3h的耐冷萌发中富集，53个基因在0h对3h的冷敏萌发中富集，61个基因在0h对6h的耐冷萌发中富集，70个基因在0h对6h的冷敏萌发中富集，53个基因在0h对12h的耐冷萌发中富集，75个基因在0h对12h的冷敏萌发中富集(图7)。在耐冷数据集中丰富的术语中，“对外部刺激的反应”、“对生物刺激的反应的调节”和“氧化还原酶活性”在0h和12h之间存在；在冷敏感数据集中，“防御反应”、“对外部刺激的反应”和“氧化还原酶活性”在0h和12h之间存在。在耐冷性数据集中丰富的术语中，“膜蛋白复合体”和“对外界生物刺激的反应”在0h和24h观察到，而在冷敏感数据集中丰富的术语中，“氧化还原酶活性”在0h和24h中观察到。
基因调控途径是一个动态的、连续的过程。途径富集被广泛应用于了解水稻对冷处理反应的生物学进程。因此，研究人员分析了ce253和Y12-4中的富集途径，特别是苯丙烷的生物合成是除了ce253-0h和ce253-3h外所有富集中最重要的。随着冷处理时间的延长，信号转导途径的基因数量增加。此外，在ce253-0h和ce253-6h的代谢途径中发现了相当数量的基因，但在Y12-4-0h和Y12-4-24h的单条代谢途径中的基因数量多于Y12-4的其他三个项。植物激素信号转导途径在ce253-0h与ce253-3h分别为TOP 1,ce253-0h与ce253-6h，ce253-0h与ce253-12h，ce253-0h与ce253-24h分别降至TOP 3、TOP 6和TOP 13。然而，植物激素信号转导途径在Y12-4-0h与Y12-4-3h分别为TOP 2，而在Y12-4-0h与Y12-4-6h、Y12-4-0h与Y12-4-12h、Y12-4-0h与Y12-4-24h分别降至TOP 3和TOP 9。这些数据表明，Y12-4的植物激素信号转导维持在较高水平。耐冷萌发比冷敏感萌发更能有效地维持冷处理下的植物激素信号转导。用qRT-PCR分析了7个表达明显变化的基因，以验证RNA-seq数据结果。所有这些基因都被预测与冷处理相关。在qRT-PCR分析中，Os01g0695700、Os07g0515100、Os05g0149400、Os12g0576600、Os11g0523700、Os02g0312600、以及Os02g0535400的表达模式与RNA-Seq分析结果相似。这一结果表明了RNA-Seq研究的有效性(图8)。
图8 比较RNA-Seq和qRT-PCR的基因表达水平。根据RNA-Seq鉴定的核苷酸多态性，研究人员从WGCNA的棕色和绿色模块中筛选出3个相对表达量高、表达模式不同的基因，分别在ce253和Y12-4之间进行克隆和功能鉴定。WGCNA的结果表明，CBF2调控绿黄色模块中的LTG5。LTG5负责编码UDP-葡萄糖基转移酶，并负责Y12-4对冷处理的响应。根据已有的日本晴LTG5核苷酸序列，LTG5在Y12-4~ce253之间的启动子区域有1个SNP和1个Indel。LTG5在Y12-4中的表达在发芽期的耐冷过程中起着重要作用(图9)。
图9 LTG5在萌发期的功能分析。A. 在低温胁迫下生长的NT植株和LTG5-OE植株的表型。B. 冷胁迫下NT和LTG5-OE植株结实率的统计结果。C. 对NT和LTG5-OE植株根系显微结构的观察。为了评估LTG5的功能，将35S启动子驱动的含有Y12-4 LTG5基因导入ce253。RT-PCR结果表明，独立的T0转基因株系表现出不同程度的LTG5表达，qRT-PCR也证实了T3株系中LTG5基因的表达。对LTG5的3个过表达转基因株系进行了进一步的分析，发现与非转基因株系(NT)相比，OE-LTG5在冷处理条件下表现出稳定的冷胁迫耐性。与NT相比，低温下OE-LTG5-1、OE-LTG5-2和OE-LTG5-3的发芽率分别提高了96.97%、61.11%和37.78% (图9)。OE株系叶片在低温胁迫下，泡状细胞和薄壁细胞破裂，而叶肉组织、维管束和机械组织保持其结构和形态。然而，NT的叶片中有泡状细胞、机械组织和薄壁细胞断裂(图9)。研究人员使用qRT-PCR检测LTG5在不同水稻组织中的表达，以确认LTG5的空间表达模式(图10)。LTG5在几种水稻组织中广泛表达，如鞘、叶、茎、根、穗、节、颈、种子、旗叶和分蘖组织。LTG5在种子中的表达量最高(图10)。利用35S启动子控制的融合蛋白LTG5-绿色荧光蛋白(GFP)在水稻原生质体中表达，以保证LTG5的亚细胞定位。如图10B所示，在35S：LTG5-GFP转基因原生质体细胞中仅在膜上观察到GFP荧光。因此，这一结果表明LTG5是一种膜和细胞核定位的蛋白，与其在水稻生长发育调节中的功能是一致的。
图10 LTG5在组织中的表达及亚细胞定位。A. LTG5在组织中的表达。B. LTG5的亚细胞定位。本文揭示了耐冷普通野生稻和冷敏籼稻在低温胁迫下的不同分子变化。RNA-seq分析结果表明，耐冷基因型和冷敏感基因型的冷响应转录水平存在较大差异。研究人员的转录组数据可以用来识别耐冷候选基因的新靶点。此外，本研究还从野生稻中发现了耐冷基因LTG5。LTG5编码一种UDP-葡萄糖基转移酶，在调节冷胁迫下发芽率中起重要作用。然而，还需要进一步的研究来确定基因表达和冷处理响应之间的这种联系。本研究表明，野生稻基因LTG5在该作物对冷胁迫的高耐性中起到了一定的作用。通过比较野生稻、籼稻和LTG5的冷适应机制，探索耐冷基因，从而提高水稻耐冷性育种水平。本研究结果有助于研究人员了解水稻和野生稻的冷反应机制，并为水稻生物技术和分子育种的改进提供技术资源。
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