科研 | PLANT PHYSIOL：转录因子GmMYB29A2调控大豆对大豆疫霉的抗性
编译：YQ，编辑：景行、江舜尧。
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大豆抗毒素同分异构体I、II和III是大豆受病原诱导的主要次生代谢产物，它们可与其他5-脱氧异黄酮共同对大豆疫霉产生种特异抗性。NAC家族转录因子GmNAC42-1是大豆抗毒素生物合成的必要调控因子，而抗毒素基因调控网络的其他必要转录因子有待鉴定。本研究对大豆品种Williams 82的毛状根进行转录组比较，并利用大豆细胞壁葡聚糖激发子处理Harosoy 63种子，发现了两个同源R2R3型MYB转录因子基因GmMYB29A1和GmMYB29A2在抗毒素生物合成高峰时上调。过表达和RNA干扰沉默GmMYB29A2分别增加和降低了GmNAC42-1、GmMYB29A1和抗毒素生物合成基因和代谢产物的表达，影响对细胞壁壁葡聚糖激发子的响应。与此相反，过表达或沉默GmMYB29A1会减少抗毒素I的积累，对生物合成基因的表达有微弱或无影响，表明GmMYB29A1在促进抗毒素的生物合成途径中具有优先作用。GmMYB29A2在体内外均与两个抗毒素I生物合成基因的启动子相互作用。在编码抗性基因Rps1k的大豆品种Williams 82中沉默GmMYB29A2，其与大豆疫霉1号小种兼容，而过表达GmMYB29A2使Williams恢复抗性。因此，GmMYB29A2对大豆疫霉抗性基因以及大豆抗毒素的积累和表达至关重要。
论文ID
原名：Glyceollin Transcription Factor GmMYB29A2 Regulates Soybean Resistance to Phytophthora sojae
译名：转录因子GmMYB29A2调控大豆对大豆疫霉的抗性
期刊：Plant Physiology
IF：6.902
发表时间：2020年6月
通讯作者：Nik Kovinich
通讯作者单位：西弗吉尼亚大学植物与土壤科学学系
DOI号：10.1104/pp.19.01293
实验设计
结果
大豆抗毒素可通过两种机制生物合成，从头合成机制是指从PHE氨裂解酶基因（PAL）的表达到后期抗毒素生物合成基因的表达，转化机制是指异黄酮缀合物6''-O-大豆苷的水解为抗毒素生物合成提供中间体（图1）。
W82毛状根经WGE处理后积累抗毒素I、II和III（图2A）。6''-O-丙二酰黄豆苷的含量随抗毒素积累的增加显著下降（图2B）。RT-qPCR显示GmNAC42-1、异黄酮合成酶基因IFS2、甘氨酸4-二甲基丙烯基转移酶基因G4DT表达上调6.7-14.3倍（图2C）。说明W82毛状根抗毒素的从头合成机制和转化机制都很活跃。相比之下, H63种子的抗毒素代谢物及其生物合成基因表达上调，而大豆苷轭合物含量没有减少（图2D-E）。
图1. 病原体诱导的异黄酮生物合成途径。CM：分支酸变位酶，PAT：转氨酶，ADT：脱水酶，PAL：氨裂解酶，4CL：4-香豆酸辅酶A连接酶，CHS：查耳酮合酶，CHI：查耳酮异构酶，CHR：查耳酮还原酶，IFS：异黄酮合成酶，I29H：异黄酮29-羟化酶，G4DT：甘氨酸4-二甲基烯丙基转移酶，G2DT：甘氨酸2-二甲基丙烯基转移酶，GLS：大豆抗毒素合成酶。
图2. 大豆疫霉WGE处理W82毛状根和H63种子中抗毒素和黄素糖苷的积累。A：W82毛状根乙醇水溶液提取物UPLC-PDA色谱图；B：W82毛状根代谢物含量差异；C：W82毛状根的相对基因表达水平；D：H63种子代谢物含量变化。E：H63种子的相对基因表达水平。
2 响应大豆疫霉激发子的转录因子
对W82毛状根和H63种子在各自最大抗毒素积累时进行RNA-seq（图2）。在W82毛状根和H63种子中分别鉴定了5702和3852个差异表达基因，其中1049个基因在两种组织中均上调（图3A）。从莽草酸途径基因PAT到抗毒素生物合成基因G4DT的大多数转录本在两种组织中均表达上调（表1）。1049个基因的GO富集于转录因子，占14.3%（图3B）。其中MYB转录因子最多（14.0%），其次是WRKY家族（11.3%）（图3C）。在10个最高表达的转录因子中，有3个乙烯响应因子（ERF）和3个MYB家族转录因子（表2）。
表1. WGE处理H63种子和W82毛状根中上调的抗毒素生物合成基因
表2. H63种子和W82毛状根中高表达的转录因子基因
图3.上调表达的转录因子基因的GO富集。A：H63种子和W82毛状根中显著上调的基因数；B：GO基因富集；C：转录因子基因家族。
3 大豆抗毒素调控因子GmMYB29A1和GmMYB29A2的基因表达和系统发育
上调最高的两个MYB基因是GmMYB29A1和GmMYB29A2（表2）。在H63种子中它们的表达上调3.33倍和2.81倍，在W82毛状根中表达上调2.48倍和0.87倍（图4A）。RNA-seq显示这两个基因的表达不受发育调控，表达模式不同于异黄酮糖苷生物合成基因和GmMYB176转录因子（图4B）。全基因组关联研究发现GmMYB29在大豆器官发育过程中正调控异黄酮糖苷生物合成，RNA-seq显示，与GmMYB176一样，GmMYB29的表达受发育调控（图4B）。
对GmMYB29A1和GmMYB29A2进行系统发育分析，发现它们与R2R3型MYB的AtMYB14和VvMYB14关系最密切（图4C）。AtMYB14调控拟南芥耐寒性，VvMYB14调控葡萄抗菌素合成。其他聚类蛋白包括AtMYB34、AtMYB51、AtMYB122，它们间接调控拟南芥抗毒素合成，AtPAP1和AtMYB75调控花青素生物合成，AtPFG1、AtMYB12、AtPFG2、AtMYB11、AtPFG3、AtMYB111调控黄酮醇糖苷生物合成。
蛋白质序列分析发现GmMYB29A1和GmMYB29A2蛋白在其N端区域编码R2R3型DNA结合结构域，与GmMYB29相似性91%（图4D）。一些MYB转录因子，如花青素调控因子AtPAP1/AtMYB75需与bHLH转录因子以基序进行物理结合，而GmMYB29A1和GmMYB29A2仅编码了该基序的50%残基。在C端，GmMYB29A1/GmMYB29A2与GmMYB29相似度83%和49%（图4D）。GmMYB29A1和GmMYB29A2都含有与应激反应相关的SG2基序。GmMYB29A2和GmMYB29A1在SG2基序上只有一个氨基酸差异。因此GmMYB29A1和GmMYB29A2可能与GmMYB29具有相似地调控异类黄酮基因的功能。
图4. GmMYB29基因表达水平与系统发育。A：RT-qPCR检测W82毛状根的基因表达；B：大豆器官发育的时空基因表达，G4DT是抗毒素生物合成的标记基因，HIDH是异黄酮糖苷生物合成的标记基因。C：GmMYB29A1和GmMYB29A2蛋白系统发育树。D：GmMYB29A1和GmMYB29A2的氨基酸序列比对。
4 GmMYB29A2是抗毒素I生物合成的正调控因子
在WGE处理的W82毛状根中沉默GmMYB29A1或GmMYB29A2的基因表达（图5A）。结果表明GmMYB29A1的沉默不影响GmMYB29A2、GmNAC42-1或抗毒素生物合成基因的表达。而G4DT的表达减少1.5倍（图5B），抗毒素I水平降低1.6倍（图5C）。GmMYB29A2的沉默使GmMYB29A1、GmNAC42-1、IFS2、I2H和G4DT的表达量降低1.7-15.2倍（图5D），导致抗毒素I减少3.4倍，6''-O-大豆甙、黄豆苷元、6''-O-丙二酰木甙含量增加1.5- 4.9倍（图5E）。
在W82毛状根中过表达GmMYB29A1和GmMYB29A2编码序列。过表达GmMYB29A1使GmMYB29A2和G4DT表达下调1.33- 1.45倍，其它抗毒素基因表达无变化（图5F），导致抗毒素I减少1.9倍（图5G）。GmMYB29A2过表达导致GmNAC42-1、GmMYB29A1以及许多生物合成基因表达上调（图5H），使抗毒素水平提高2.0-4.2倍（图5I）。这些结果表明GmMYB29A2是GmNAC42-1的正调控因子，激活抗毒素I生物合成。
图5. GmMYB29A1和GmMYB29A2的功能表征。A：GmMYB29A1和GmMYB29A2的RNAi靶位示意图；B：GmMYB29A1沉默的毛状根基因表达；C：RNAi-GmMYB29A1根中异黄酮含量；D：GmMYB29A2沉默的毛状根基因表达；E：RNAi-GmMYB29A2根中异黄酮含量。F：过表达GmMYB29A1的W82毛状根基因表达；G：p35S::GmMYB29A1毛状根中异黄酮含量；H：过表达GmMYB29A2毛状根基因表达情况；I：p35S::GmMYB29A2毛状根中异黄酮含量。
6 GmMYB29A2结合抗毒素生物合成基因IFS2和G4DT启动子
克隆GmMYB29A2编码序列，转化至CaMV-35S启动子（p35S），在大豆毛状根中融合表达，结果表明nGFP-GmMYB29A2定位于细胞核。电泳迁移率实验（EMSA）表明GmMYB29A2纯化蛋白与带标记的G4DT和IFS2启动子区域相结合（图6A-B）。酵母单杂交表明GmMYB29A2蛋白结合异黄酮生物合成基因IFS2和抗毒素I基因G4DT启动子的MYB识别元件（图6C-D）。
图6. GmMYB29A2结合抗毒素生物合成基因启动子。A：G4DTpro2-577和IFS2pro2-479上的MYB结合元件；B：纯化GmMYB29A2蛋白与G4DTpro2-577和IFS2pro1-479的电泳迁移率实验。C：G4DT和IFS2启动子片段的预测MYB结合元件；D：酵母单杂交试验。
7 GmMYB29A2介导对大豆疫霉1号生理小种的抗性
研究表明5-脱氧异黄酮对大豆疫霉具有特异抗性。本研究假设抗毒素调控因子GmMYB29A2在耐药性中发挥作用。利用RNAi对W82的毛状根的GmMYB29A2进行沉默，表明W82对大豆疫霉1号生理小种具有特异抗性。从大豆疫霉接种开始，观察水渍型病斑长度。在W82中GmMYB29A2沉默导致症状发展在2-4d增加2.4-2.7倍（图7A）。RNAi-GmMYB29A2根中可见水渍病斑和菌丝（图7B）。代谢物分析表明W82累积217.5mg/g的抗毒素Ⅰ，是消灭大豆疫霉的有效剂量，而RNAi-GmMYB29A2根抗毒素累积81.8mg/g。5-脱氧异黄酮类化合物和衍生异黄酮类化合物的含量没有明显降低。过表达GmMYB29A2时病情发展减少4.0-5.8倍（图7D）。Williams大豆野生型易看出菌丝生长，但GmMYB29A2过表达株中显著减少（图7E）。过表达株中抗毒素Ⅰ的含量为110mg/g，是野生型的2.0倍（图7F）。这些结果表明GmMYB29A2在调控抗毒素I的生物合成和对大豆疫霉的抗性上发挥作用。
图7. RNAi沉默或过表达GmMYB29A2对接种大豆疫霉的毛状根病情发展的影响。A：MYB29A2基因在W82毛状根中沉默表达时的平均损伤长度；B：病情发展表型；C：RNAi根接种大豆疫霉后的异黄酮含量。D：MYB29A2在感病品种Williams中过表达时的平均损伤长度；E：Williams病情发展表型；F：MYB29A2过表达根接种大豆疫霉后的异黄酮含量。
结论
1 GmMYB29A2对抗毒素生物合成至关重要
RNA-seq发现R2R3 MYB转录因子基因GmMYB29A2和GmMYB29A1上调时促进抗毒素生物合成。它们在根和种子中的表达模式与GmNAC42-1一致，GmNAC42-1是一种必要的抗毒素合成转录因子。GmMYB29A2仅在激发子处理时高表达，而过表达GmMYB29A2可在没有WGE处理下上调G4DT表达，但没有导致抗毒素生物合成，这表明它独立调控大豆苷元转化为抗毒素所需的所有基因。GmMYB29A2可能无法调控的基因包括2-羟基异黄酮还原酶IFR1/IFR2、紫檀碱合酶PTS、二羟紫檀碱6-羟化酶P6aH/CYP93A1、甘氨酸2-二甲基丙烯基转移酶G2DT、抗毒素合成酶GLS。此外，GmMYB29A2可能无法调控代谢物中间体的亚细胞运输，包括内质网、叶绿体、核内体。
在W82毛状根中过表达GmMYB29A1会下调GmMYB29A2和G4DT表达，但不会下调其他抗毒素生物合成基因的表达。脉冲追踪实验表明大豆疫霉不仅诱导抗毒素I的生物合成，还提高其转化率，抗毒素I并不是该途径的最终产物。由于过表达GmMYB29A1对多数抗毒素生物合成基因的表达有影响，因此认为它通过诱导酶的表达降低抗毒素I的水平。GmMYB29A1的作用可能是限制抗毒素I的水平。
2 氨基酸序列C端区分GmMYB29A2和GmMYB29A1在抗毒素生物合成上的功能
过表达GmMYB29A2和GmMYB29A1对抗毒素积累有正反向的影响，而这两种蛋白有90%相似性。一般MYB转录因子通过N端保守基序与bHLHs转录因子产生竞争作用，激活或抑制苯丙类的生物合成。然而GmMYB29A2和GmMYB29A1具有相同的N端序列。GmMYB29A1和GmMYB29A2的C端相似度86%。GmMYB29A1不编码C端抑制子基序，这些基序保守存在于其他MYB转录因子中，抑制苯丙醇类的生物合成。GmMYB29A1编码C端SG2基序，SG2基序与苯丙类生物合成反应相关，如拟南芥中低温和病原体诱导的木化反应、葡萄中病原和UV-C诱导的苯乙烯生物合成、粗叶木中谷胱甘肽诱导的异黄酮生物合成。GmMYB29A2和GmMYB29A1的SG2基序只有一个氨基酸差异，GmMYB29A2在这个位置编码丝氨酸，而GmMYB29A1编码脯氨酸。因此，GmMYB29A1和GmMYB29A2的功能差异在某种程度上是由C端氨基酸残基差异所决定。由于MYB转录因子的C端通常与其他蛋白相互作用，从而激活或抑制基因靶标的转录，可以推断GmMYB29A2和GmMYB29A1不同的C末端通过介导不同的蛋白相互作用而发挥不同的功能。
3 GmMYB29A2介导的对大豆疫霉的抗性
研究表明，抗性大豆品种能迅速积累抗毒素，这种脱氧异黄酮类化合物对大豆囊状线虫、大豆锈病菌和大豆疫霉发挥作用。过表达脱氧异黄酮生物合成基因可增强对黄豆蚜小种的抗性。沉默GmMYB29A2的W82毛状根只影响抗毒素Ⅰ水平，而不影响其他脱氧异黄酮物质。抗毒素在体外对多种大豆病原菌有毒性作用，其中大豆疫霉特别敏感，可能是因为它缺乏分解抗毒素的酶。然而，一些病原如丁香假单胞菌已经进化出直接抑制异黄酮生物合成的效应子。因此，过表达GmMYB29A2表现的作物抗性的有效性取决于病原菌种类。没有WGE处理下，过表达GmMYB29A2不能产生抗毒素。因此，GmMYB29A2仅发挥部分调控作用。
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