科研| PNAS：农业生态系统的多组学分析揭示了有机氮在提高农作物产量中的重要作用

编译：王艳林，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

在全球无机肥料使用量和农作物产量都增加的背景下，由于土壤中氮的浸出，水体的污染也随之增加。迫切需要设计一种与环境相和谐的农业生态系统。由于农业生态系统非常复杂，并且由植物，微生物和土壤之间相互纠缠的相互作用网组成，因此，难以确定作物生产中的关键组成部分。为了了解通过多种耕作方法（包括土壤日晒处理）设计的农业生态系统中的网络结构，我们采用多组学的方法对种植有小松菜的田地进行了研究。我们发现，土壤日晒增加了植物苗生物量，而与施用的肥料类型无关。我们的多元组学和综合信息学揭示了农业生态系统中的复杂相互作用，显示出以植物性状与土壤代谢物，矿物质和微生物异质相关的多个网络模块。出乎意料的是，我们确定土壤日晒诱导的土壤有机氮是增加作物产量的关键因素之一。无菌植物体外试验和使用适于耕种土壤进行的盆栽实验证实，特定的有机氮，即丙氨酸和胆碱，通过充当氮源和生物活性化合物而直接增加了植物的生物量。总之，我们的研究表明在农业生态系统水平上有机氮在植物生长中可发挥关键性的作用。

论文ID

原名：Multi-omics analysis on an agroecosystem reveals the significant role of organic nitrogen to increase agricultural crop yield

译名：对农业生态系统的多组学分析揭示了有机氮在提高农作物产量中的重要作用

期刊：PNAS

IF：9.412

发表时间：2020年6月

通讯作者：Yasunori Ichihashi

通讯作者单位：理研生物资源研究中心，日本科学技术厅

实验设计

实验结果

1 SS在农田上种植的农作物中诱导的增长反应（IGR）

为了剖析采用不同耕作方式设计的农业生态系统，我们在裂区设计的农田中种植了小松菜，对该农田的主要作用是SS，次要作用是肥料，并通过多个环境传感器进行监控（图1A）。在SS处理期间，一天累积的土壤温度超过1000℃，并且在10 cm的土壤深度下，SS处理后土壤的氧化还原电位（Eh）保持在约200 mV，其中兼性厌氧细菌繁殖的更好。与以前的观察一致，SS降低了杂草覆盖率，而我们也检测到有机堆肥甚至在非日日晒（NS）地块中也降低了杂草覆盖率（图1B）。不论肥料类型如何，SS都增加了植株的干重（图1C），证实了SS诱导的IGR效应。考虑到SS和NS处理之间的作物表型质量（即代谢物谱，叶形特征，光合作用速率，糖含量，叶绿素和味觉指数）没有显著差异，SS可能会诱导土壤中更多的养分释放，并刺激植物的生理和形态变化以增加养分获取，而不是改变植物资源分配中的生长/免疫权衡。此外，即使在第二年交换了SS和NS地块的位置，我们也观察到了IGR对作物产量的强烈影响（鲜重[g]/m²）。

图1 在农田上种植的农作物中检测到SS诱导的IGR。（A）小松菜栽培的裂区设计农田和综合组学方法的实验设计。（B）每个地块上收获的杂草数量。（C）收获阶段植株干重（n = 8株植物）和叶片图像（**P <0.01，通过单向方差分析和Tukey事后检验进行分析）。（比例尺：10 cm。）SS，土壤日晒；NS，非日晒；Che，化肥；Org，有机堆肥。

2 农业生态系统中的土壤代谢，矿物质和细菌动态

为了检测SS诱导的IGR的农业生态系统中土壤代谢，矿物质和细菌分布的变化，我们进行了基于NMR的代谢组学，基于ICP-OES的ionomics和细菌16S rRNA基因扩增子测序分析（图1A）。所有土壤代谢组和ionomics数据的主成分分析（PCA）表明，根据每个实验地块将土壤样品彼此分开分组，验证了我们的实验处理（图2A）。出乎意料的是，在播种期或收获期的实验处理之间，土壤无机氮（NH₄⁺-N和NO₃-N）的浓度没有显著差异（图2B），表明本研究中观察到的SS诱导的IGR效应可能是由SS土壤中氮通量速率（即植物吸收速率）的增加引起的，同时保持处理过程中有机形式分解为无机形式的平衡，或与普遍认为无机氮是农作物的主要氮源的观点有所不同。

如先前关于拟南芥和水稻微生物组的研究报道，使用家族水平OTUs进行的Bray-Curtis相异度（β多样性）的非度量多维标度（NMDS）使我们能够检测土壤和根际细菌群落结构的差异。检测到的差异可能是由于土壤和根际之间的分散异质性引起的。有趣的是，仅在根际细菌的群落结构上检测到SS，而在土壤细菌上未检测到（图2C）。PERMDISP分析表明，SS诱导的根际细菌群落结构的分化反映了细菌谱的变化，而没反映分散的异质性。SS和NS处理之间的菌门比例存在巨大差异：与NS地块相比，在SS地块中，厚壁菌门和奇球菌属-栖热菌属被富集，而疣微菌门，浮霉菌，螺旋体门，酸杆菌门和WS2都被消耗掉（FDR <0.05；图2D）。此外，我们发现被称为植物生长促进根际菌的类芽孢杆菌属（厚壁菌门）和假单胞菌属（变形菌门）在SS地块中的根际细菌谱中被高度富集，实际上，这些细菌可以从经过SS处理的土壤中生长的植物根中分离出来。这些数据表明，尽管土壤细菌谱在植物培养过程中被破坏，但SS可以在菌门水平上组装并维持根际细菌的特定群落分布。

图2 SS通过代谢，矿物质和细菌动态诱导土壤养分循环。（A）通过PCA分析的土壤代谢组和离子组谱。（B）播种和收获阶段土壤中无机氮的浓度。（C）使用Bray-Curtis距离矩阵通过NMDS分析的根际和土壤中的微生物组谱。

3 综合网络分析将有机氮确定为农业生态系统中的关键组成部分

在我们调查的农业生态系统中，SS处理而非肥料类型主要解释了综合全组学数据的变化，包括植物表型，植物代谢组，土壤代谢组，土壤离子组和根际微生物组。为了深入了解农业生态系统中的响应网络结构，我们使用综合的全组学数据构建了一个无符号相关网络。最终的网络有9个主要模块，包括由Fast-Greedy模块化优化算法确定的20多个节点（图3A）。这表明，在农业生态系统中看到的复杂相互作用显示出由与土壤代谢物，矿物质和细菌异质相关的植物性状代表的多个网络模块，这些模块与其他生物网络系统具有关键的结构相似性。包括植株干重的模块M7除具有矿物质和根际细菌，如嗜热细菌外，还具有土壤有机氮作为高度相关的中枢代谢产物（图3B和C）。M7与其他具有与作物品质有关的特性（例如味道，糖度，植物钠和植物氮）的其他模块（M1，M4，M5和M8）相连，但与在土壤中具有无机氮NO₃-N的模块M6不相连（图3A）。这使我们可以假设，在M7中检测到的土壤有机氮直接影响植物的生长，并且是SS在作物生产过程中诱导的关键成分。

图3 综合网络可识别与作物产量相关的根际微生物和有机氮源。（A）基于无符号相关网络和Fast-Greedy模块化优化算法构建的综合网络。节点和边缘分别表示组学检测和组学检测之间基于相关性的相互作用。边缘宽度表示相互作用的权重。九个主要模块（从M1到M9）由不同颜色的节点表示。（B）归类为M7模块的综合数据的关联网络。节点的大小和色标分别表示对数强度和强度。（C）M7模块的热图可视化。SS，土壤日晒；NS，非太阳能化。

4 SS诱导的有机氮直接增加了农作物的产量

我们通过从综合网络分析中确定的SS诱导的有机氮的应用实验验证了该假设。为了排除细菌和土壤酶活性可能使有机氮矿化的可能性，我们建立了体外无菌小松菜系统。当用等量（5 mM氮）的无机氮或丙氨酸生长时，小松菜的生物量相似，而N-甲基甘氨酸，缬氨酸和亮氨酸抑制植物生长（图4A和C）。这表明诸如丙氨酸的有机氮可以作为氮源增加植物茎生物量。另外，在无机氮下补充施用有机氮（占总氮量的1％）表明，与在相同氮浓度下仅施用无机氮相比，与无机氮一起施用胆碱，丙氨酸或亮氨酸可以增加小松菜的生物量（图4B和C）。鉴于胆碱刺激了原生质体中的光合作用，据报道叶面施用胆碱可促进草本植物的生长，因此胆碱可作为生物活性化合物来促进植物生长。通过以下事实证实了这一点：足够的无机氮（30 mM氮）与胆碱（占总氮的0.17％）补充施用仍可增强小松菜的生长。

相反，我们的体外测定表明丙氨酸不仅可以用作氮源，而且还可以用作生物活性化合物。为了揭示植物如何在不存在细菌和土壤酶活性的情况下摄取和利用丙氨酸，我们再次使用了无菌的小松菜系统，将双标记（¹⁵N，¹³C）丙氨酸应用于根部使用LC-MS检测植物中双标记丙氨酸的独特光谱。我们的数据清楚地表明，标记的丙氨酸在1小时内被运输到嫩芽组织中，随后在长达6小时内被运输到成熟组织中（图4D）。此外，通过NMR在茎中的丙氨酸，琥珀酸，谷氨酰胺和脯氨酸中检测到根部经过双标记的丙氨酸衍生的¹³C（图4E），表明吸收的丙氨酸在6小时内通过三羧酸（TCA）循环代谢为其他氨基酸。使用标记的丙氨酸（¹⁴C-丙氨酸）获得的放射自显影照片证实，源自丙氨酸的¹⁴C积累在嫩芽顶部幼叶的增生区域中（图4F）。这些数据表明，小松菜可以吸收并利用丙氨酸作为氮源，可能绕过了常见的矿化途径，以节省将吸收的无机氮转化为氨基酸的代谢能。

最后，为了重现丙氨酸在农田的作用，我们使用两种不同类型的适于耕种土壤进行了盆栽试验。与我们的体外试验一致，丙氨酸的施用增加了灰色低地土壤和暗色土中小松菜的生长，其增幅与无机氮相同（图4G和H）。在植物种植过程中，土壤中的丙氨酸浓度降低而硝酸盐浓度趋于增加（图4I），这表明土壤中的丙氨酸可以被植物直接吸收并分解为无机氮。综上所述，我们的数据表明SS可能导致有机氮的积累，有机氮很可能充当直接和间接的氮源以及具有生物活性的化合物，从而增加作物的产量。

图4 有机氮可被用于增加农作物的产量。（A）有机氮作为植物生长的氮源（5 mM氮浓度）的评估。（B）有机氮作为补充施用（占总氮量的1％）与无机氮共同施用用于植物的生长。（C）图像代表每种处理方法的14日龄小松菜幼苗。（比例尺：1 cm。）（D）通过LC-MS分析双标记的丙氨酸渗入芽组织中。（E）通过NMR检测从吸收的丙氨酸中代谢的由¹³C-标记的化合物（即丙氨酸，琥珀酸，谷氨酰胺和脯氨酸）。（F）用标记的丙氨酸追踪的芽中¹⁴C的积累。（比例尺：1 cm）（G）通过使用田间土壤的盆栽试验分别评估灰色低地土壤和暗色土的丙氨酸（H）图像代表每种处理在灰色低地土壤上生长的18日龄小松菜幼苗。（比例尺：3 cm）。（I）在盆栽试验期间（0、1、2周）土壤中丙氨酸和硝酸盐浓度的变化。

讨论

我们的研究在不同管理方式农业生态系统的复杂相互作用中发现了异质模块结构（图2）。这表明不同土壤参数中的成分相互影响以协调复杂的农业生态系统或“黑匣子”，这阻碍了尝试以植物表型的形式解释来自不同管理实践的“投入”和“产出”之间的联系。基于检测到的模块结构，我们评估了哪些土壤成分与植物表型有关。出乎意料的是，我们发现在SS诱导的IGR效应中，有机氮而非无机氮是作物生长的重要组成部分（图3），这一点已通过体外试验和使用可耕土壤的盆栽试验得到了证实（图4）。相反，土壤无机氮与植物中的糖含量呈正相关，原因是由于植物复杂的内部调控，无机氮的供应会刺激光合作用，但并不总是增加产量。除土壤有机氮外，模块M7还具有多种根际细菌，包括类芽孢杆菌科和栖热菌科（图3）。这些细菌可能在农作物生产中具有特定功能，并参与农业生态系统中典型微生物组的构建。值得注意的是，丙氨酸和胆碱是通过综合网络分析检测到的，而不是通过成对比较检测到的。仅使用代谢组数据，PCA可以发现区分SS和NS处理的贡献代谢物包括丙氨酸和胆碱，而使用多组学数据进行的综合网络分析可以检测出这些土壤代谢物与作物产量之间的相关性。这表明我们的综合组学方法具有预测能力，可检测植物，微生物和土壤之间的多层次相互作用，并确定农业领域研究中的关键组成部分。

尽管对植物营养中的有机氮进行了深入研究，但有机氮对农作物产量的贡献仍不清楚和有争议。显然，即使在无机氮存在下，农作物也能够吸收氨基酸。另外，在农田中，氨基酸转运蛋白参与氨基酸的吸收。但是，与农田中无机氮的吸收相比，完整氨基酸的吸收率较低，而树木则显示出较高的有机氮吸收率。因此，缺乏直接的证据表明有机氮在农业领域为植物营养贡献了大量氮。我们评估农业生态系统中响应性相互作用的研究表明，在农田中，有机氮而不是无机氮会随作物产量的变化而变化。我们使用人工培养基的体外测定和使用可耕土壤的盆栽实验表明，氨基酸的使用导致作物产量增加，尽管活性氮的形式仍不清楚。总之，本研究显示了一个明确的案例，即土壤中有机氮的存在对植物氮营养起着至关重要的作用。

我们发现在植物栽培过程中土壤碳氮比降低，但是在苗期和收获期，SS和NS处理之间的碳氮比没有发现任何差异。尽管对氮浓度进行更高分辨率的测量是有必要的，但这表明SS处理可能不会影响有机氮分解的整个过程，而是会产生特定类型的有机氮。我们的网络分析表明，与作物产量相关的模块除有机氮外还包括根际细菌。因此，这些细菌有可能在特定类型的有机氮分解中具有某些功能。由于丙氨酸刺激水稻中丙氨酸的转运活性，即使在存在无机氮的情况下胆碱也会增加根生物量，SS诱导的有机氮可能会重新调整植物以增加对有机氮的获取。我们的发现暗示有机氮可以促进植物营养，并有可能在未来的作物生产中减少化学肥料的使用。

评论

化肥在当今农业发展过程中一直占有举足轻重的地位，然而化肥的使用造成了严重的环境污染。而随着人们对农业生态系统的研究发现，植物、微生物和土壤之间的相互作用对于维持良好的农业生态系统是有必要的。本研究采用多组学的综合分析发现土壤日晒可以通过多种方式导致作物产量增加，如土壤日晒可以造成土壤有机氮含量在播种期的短暂消耗以及在收获期的富集，此外土壤日晒还会改变农田中根际细菌群落。然而最重要的是该研究揭示了不同管理模式下农业生态系统的网络结构变化并明确了有机氮是土壤日晒诱导的作物增长反应的关键组分。该研究有望为未来减少农业生产过程中化学肥料使用提供指导。

原文链接：https://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1917259117