科研 | Talanta：基于LC-HRMS提取分析策略研究完整的头发代谢组
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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近年来，代谢组学被认为是研究生物机制和发现生物标志物的最先进技术。但是，代谢组的固有动态和敏感特性一直在挑战使用生物液体（如尿液和血液）捕捉感兴趣时间点的准确性，因此，头发已成为长期和回顾性测定的有价值的分析标本。不幸的是，尽管人们对全球头发代谢组学有明显的兴趣，但很少有研究对提取策略进行优化。本研究采用单因素实验设计系统考察了毛发代谢物的提取工艺，对水溶液中3种pH值(酸性、中性和碱性)、6种萃取溶剂(甲醇、乙腈、丙酮、磷酸盐缓冲液、去离子水和二氯甲烷)、不同组成的混合溶剂及其顺序萃取，以及萃取时间(15、45、60、120、240和480分钟)进行了考察。毛发提取的理想条件是在+55°C下用甲醇：磷酸盐缓冲液50:50（v / v）进行超声辅助提取240分钟，这种策略可以确保代谢组的真实组成，最大程度地提高信号丰度，并以一种简单的方法确保广泛覆盖广泛的代谢产物，然后将优化的提取策略与用于头发代谢组分析的结构注释工具结合在一起。在运行一次RPLC-HRMS之后，我们通过171种可能的结构和853种试验性结构的注释以及414个明确分子式的分配，实现了头发代谢产物的鉴定。综上所述，我们建立了一种有效的非靶向毛发代谢组学提取策略，该方法可用于任何分析实验室，并可通过传统的RPLC-HRMS梯度直接对样品进行分析。
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实验设计
实验结果
1. 实验设计
全球代谢组学研究的主要目标是在一次实验中获得尽可能多的代谢物的全面分子图谱，样品提取策略的选择广泛地影响着实验的成功，不幸的是，目前在全球范围内对提取策略的研究仍然很少，因为评估各种变量和响应的合理性设计是具有挑战性的。这一课题已成为代谢组学研究的热点。
通常人们会采用多独立因素的实验设计来优化提取工艺，常见的设计选项是完整的因子设计和简化的设计，如个体实验、单因子设计和部分因子设计。一个完整的因子设计包含所有因素的所有可能的水平组合，能够检查因素之间的交互作用，然而，这并不总是一个好的选择。组合的数量可能过高，伴随的后勤困难和超过资源，作为替代方案，简化设计包含所有相同的独立因素，但包含较少的实验条件，然而，去除实验条件可能会导致某些影响只能以总和而非个体来衡量。决定是否使用一个完整的因子或一个减少的实验设计主要在于寻求一个战略平衡的确切的研究问题的兴趣和可用的资源。
我们的主要目的是建立一种提取策略，在简单的基础上扩大代谢物的覆盖范围和最大化信号丰度，然而，很难确定合理的因变量(反应)来恰当地评估一个由数千种代谢物组成的整个代谢组。此外，在因子设计下进行复杂的多因素分析所需要的努力可能会超过解释每个因素的影响所需要的努力。这可能是为什么大多数研究选择测试很少的方法/参数(5-9种方法)或使用单因素设计(一次一个因素;OFAT)作为评估非靶向代谢组学样品制备/分析方法的折衷方案。
根据我们对毛发代谢组提取的了解，目前只有比较提取溶剂的三个pH值的数据，所以有必要进行更系统性的比较。在本研究中，我们评价了4个常用但关键的因素，即pH值，萃取溶剂，组合溶剂混合物的组成和萃取次数。
2. pH条件的评价
与血液和尿液等常规标本相比，头发是有利的，因为它提供了更广泛的异种生物暴露或个体代谢状况的生理改变的记录，然而，头发的分析可能是困难的，因为提取方法需要从固体角蛋白基质分离分析物的能力。从理论上讲，碱性物质在酸性条件下水溶液溶解度较高，提取效果较好；碱性物质在酸性条件下水溶液溶解度较高，提取效果较好；因此，萃取溶剂的pH值可能是一个影响因素。
研究了用酸性(0.1N HCl, pH -1.1)、中性(DIW, pH -7.0)和碱性(1N NaOH, pH -11.2)溶液提取头发样品的效果。从基峰色谱图来看(图1(a))，我们在三种水溶液之间能观察到不同的色谱模式。我们发现，与其他两种提取液相比，碱性提取液中还产生了一些额外的峰，这些峰的丰度相当显著，形状也不同，这两个离子化的特征随后被处理成维恩图(图1 (b))，重叠区域仅出现2663个特征，但基本提取过程中获得了大量的特征(19199个)。
在碱性水解过程中，毛发基质被完全溶解并释放到水溶液中。碱性提取液(补充物质1)中出现了少量的肽和氨基酸，如Gly-Val、Gly-Tyr、leu-gly、Ala-Phe、L-异亮氨酸和L-色氨酸等。尽管毛发基质的降解对某些稳定分析物具有较高的回收率，但代谢物的修饰或降解一直被认为是碱性水解的主要缺点，例如，研究表明，不稳定的氨基酸如半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸被破坏，然后形成镧酰残基和赖氨酸丙氨酸，在碱性处理下，L-氨基酸被外消旋成D-对映体。激素皮质醇和可卡因、6-乙酰吗啡和几种苯二氮卓类药物在碱性水解过程中被降解。在涉及毛发基质酸水解的研究中，已经有研究报道了丝氨酸、胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸的分解，色氨酸被完全破坏为羟吲哚丙氨酸。因为在这些严酷的条件下，只有一部分的头发代谢物可以保持稳定并避免被修改，头发基质的水解不太适合一般分析。尽管如此，仍有一些研究采用碱性或酸性水解毛发样品制备，然后进行化学衍生化，进行GC-和LC-MS分析。
Eisenbeiss等人测试了未经调整的(pH值6)、轻度酸性(pH值4)和轻度碱性(pH值8.5)的头发代谢组提取混合物，发现pH6可以更好地提取氨基酸和衍生物，同样在pH6和pH8.5下提取甘油磷酸胆碱，肉碱和饱和脂肪酸的pH值优选为8.5；烟酰胺，烟碱，尿酸和次黄嘌呤的pH值优选为4；但是，几乎对于每种化合物类别，都无法选择一种特定的pH值，作者建议未经调整的解决方案是拔毛的最佳折衷方案。
总之，强碱或强酸可以分解头发的代谢物，而温和的条件不利于头发的整体恢复。考虑到提取应反映代谢组的真实组成，避免意外的化学变化，我们决定在不调整pH值的情况下继续进行进一步的评价。
图1 三种pH值溶液提取头发样品的比较
(a)基峰色谱图和(b)维恩图表示共有和不同特征的数量。
3. 萃取溶剂评价
萃取溶剂在生物样品的代谢组研究中起着关键作用。以往对毛发分析的研究主要集中在药物滥用、金属和激素的临床或法医毒理学调查。MeOH和ACN是最常用的蛋白质沉淀试剂，溶解了从亲水有机酸到亲脂化合物的各种极性。为了特别提取脂肪酸、蜡酯、角鲨烯和胆固醇等脂类，我们采用氯仿/甲醇的溶剂混合物，用GC-MS、LC-MS或薄层色谱-火焰电离检测器进行分析。由于头发代谢组的标准化提取程序尚未建立，包括分析物的化学性质和它们对试剂的敏感性在内的几个条件都应该考虑。
在本研究中，我们评估了6种常用的提取溶剂，MeOH, ACN, ACE,PBS, DIW, DCM，以获得更好的性能和全面的头发非靶向代谢组学分析。最佳的提取溶剂应该根据以下能力来选择:产生更多的特征，提取更广泛的极性范围的特征，覆盖更多的化合物的化学多样性，并能够直接通过传统的RPLC-MS梯度进行分析，六种溶剂保留时间的峰丰度如图2(a)所示。在两种电离模式下，PBS在RT 1-8 min内产生较高的丰度，说明PBS有利于提取亲水性化合物；对于亲脂化合物，MeOH在RT 8-13分钟内具有明显的优越效果。PBS和MeOH均表现出良好的性能，弥补了RT片段的每一部分，并保证了在广泛的极性范围内的萃取率。ACE在ESI(+)模式下也提供了令人印象深刻的输出，但它在ESI(-)模式下的性能很差，此外，在头发代谢组的峰值覆盖范围中我们也观察到了类似的结果。RT段内的峰覆盖计算为峰量除以总峰量，其中每个溶剂的峰都排列在一起。S/N <10个为无峰。如图2(b)所示，很明显，MeOH和PBS在两种电离模式下的覆盖范围都更广。
接下来，我们试图对这些特征进行注释，并对提取溶剂之间的代谢物组成进行比较。我们共确定了218种化合物,并进一步分为九类:有机酸和衍生品(23%)、苯型(23%)、有机杂环化合物(20%)、脂肪和类脂分子(15%)、糖类和多酮类化合物(5%)、有机含氮化合物(5%)、有机氧化合物(3%)、生物碱和衍生品(3%)、核苷、核苷酸、类似物(3%)。在图3(a)和(b)中，218种注释化合物中有115种在所有六种溶剂中。在ACN和ACE提取的毛发中我们未检出核苷类、核苷酸类和类似物类化合物；然而，超过80%的注释化合物都在MeOH和PBS中被观察到。我们在MeOH中鉴定出另外五种独特的化合物（例如D-β-高苯丙氨酸，L-β-高亮氨酸，酪氨酸甲酯，正亮氨酸和三角果碱）；在PBS中鉴定出四个独特的化合物(例如3-甲基腺嘌呤，二氢可待因，roccellic酸和舒必利)；在ACE中鉴定出四个独特的化合物(例如，通酸，1,4-环己二酮，4-异丙基苯胺和反-2-己烯醛)；在DIW中鉴定出两个独特的化合物(例如苯胺和异烟酸)，然后我们对鉴定的四种主要化合物进行了进一步的研究(图4)，总的来说，MeOH和PBS中的丰度比ACN、ACE和DCM中的丰度更明显，然而，在苯类化合物中却发现了较大的差异和较少的分化，然而，应该指出的是，上述观察不能代表毛发代谢组的完整组成或分布。
MeOH和PBS在头发提取中的优异性能可能与它们的质子溶剂性质有关。与非质子溶剂(如ACE或DCM)不同，质子溶剂能够通过肿胀发干来促进从头发内部提取分析物。综上所述，MeOH和PBS的结合应提供更广泛的全面覆盖，因此可用于后续评估。
图2 溶剂类型对(a)峰丰度和(b)保留时间之间的峰覆盖的影响
(a)一个RT段内的丰度是峰值面积的总和，并进一步由每个RT段的最高丰度归一化。也就是说，各RT段的峰丰度最高的溶剂按1.0计算。(b) RT段的覆盖范围定义为峰量除以总峰量，其中每种溶剂的峰都排列在一起。S/N <10个为无峰。
图3 溶剂种类对鉴定化合物数量的影响
(a)显示化合物数量和分布的条形图，根据其化学性质分为九类。(b)维恩图概括了溶剂之间共有和不同化合物的数量。
图4 溶剂类型对四大类化合物丰度的影响
(a)有机酸及其衍生物；(b)有机杂环化合物；(c)苯类化合物；(d)脂类和类脂分子。
4. 溶剂混合物的评价
为了进一步优化溶剂混合物，我们应该考虑它们对不同极性代谢物的性能，产生了23种不同log P值的代谢物列表，范围从-3.7到+7.1，疏水和亲水代谢物都被选择，代表了毛发代谢组更广泛的分布。我们首先评估不同比例的溶剂混合物，MeOH:PBS 100:0,80:20, 50:50, 20:80, 0:100 (v/v)，如图5(a)所示，为了更好地显示，研究混合物之间的峰丰度按照图2(a)的方法归一化，结果表明:以50:50的比例对大多数选定的代谢物的总体提取率较高，但是我们也发现某些代谢物在使用其他混合物的提取中是有利的，例如100：0的戊二酸；酮精氨酸，茶碱，咖啡因和犬尿氨酸的比例为80:20；20:80的N6-甲基腺苷；苯甲酸，2-羟基异己酸和2-哌啶酮的比例为0：100。我们没有观察到MeOH更适合提取较高log P值的代谢物或PBS更适合提取较低log P值的代谢物的现象，仅凭其log P值无法直观预测代谢物的提取。之后，我们很好奇顺序萃取是否会比使用混合物产生更好的结果，然后在三种条件下比较毛发提取：MeOH 2小时，然后PBS 持续2 h（MeOH→PBS），PBS持续2 h，随后MeOH持续2 h（PBS→MeOH）和MeOH：PBS 50:50持续4 h（图5（b））。甲醇:PBS 50:50的混合物在两种顺序法中表现突出，可能是因为其极性、粘度、表面张力等理化性质和对超声的反应性相结合，表现出了令人满意的毛发代谢物提取倾向，然而，我们也意识到，本研究中所研究的代谢物只是整个代谢组中的一小部分，最后，以甲醇:PBS 50:50的提取率作为提取次数的评价指标。
图5 (a)溶剂混合物和(b)顺序提取对23种不同对数P值的选定代谢物丰度的影响
为了可视化目的，峰值丰度的正常化与图2(a)相同。
5. 计算提取时间
从头发中提取被分析物通常采用UAE，使用超声波浴和/或在室温或恒温浴中孵育过夜。孵育是一种将溶剂转移到样品中的技术，通过渗透和溶解过程提取分析物，然而，UAE被认为是一种更强烈的策略，因为超声波对溶剂产生高频振荡，溶剂快速流动，产生恒定的压力，导致头发结构的细胞破坏。化合物的释放是通过扩散和溶解来实现的。本文重点研究了UAE时间(15、45、60、120、240和480 min)的优化，以期为头发代谢组提取提供一种有效的策略，除此之外，我们将45分钟UAE加上960分钟孵育的额外长时间程序用作标准参考，因为这种提取时间的长度通常在文献中用于测定头发中各种化合物的含量，并且我们相信可以带来总体良好的恢复。
各代谢物在不同提取时间的相对回收率用散点图表示(图6(a))。在研究的代谢产物中，n6 -甲基腺苷和PC(16:0/ 0:0)呈线性增加；可替宁和茶碱迅速上升到高原并保持不变；丁二酸和DL -4-羟基苯乳酸先增加后减少；随着提取时间的延长，丙氨酸含量逐渐降低。这些独特的模式与我们的预期一致，因为我们处理的是一组具有巨大化学多样性的化合物。由于一种单一的方法不可能使所有种类的代谢物都有完美的产量，因此必须作出妥协以确保大多数代谢物的回收率和可检测性，240 min UAE样品的平均相对回收率大于80%。柱状图(图6(b))显示了化合物的相对回收率分为5个等级(0-20%、20-40%、40-60%、60-80%、80-100%)，240分钟UAE的样品以及45分钟UAE +960分钟培养的样品产生超过60%的代谢产物，其相对回收率为80%-100%，因此，我们认为240分钟的UAE对于一般的头发代谢组提取是足够的。
图6 提取时间对所选代谢产物相对回收率的影响
(a)每种化合物的相对回收率的散点图，(b)分为五个相对回收率的化合物百分比的柱状图。化合物的相对回收率(%)表示为从特定提取条件到7个研究提取条件中发现的最高丰度的丰度的百分比。
6. 使用优化的提取策略进行代谢组学分析和结构注释
最后，我们利用优化的提取策略对头发样品的代谢组进行了全面的分析。在正离子和负离子模式下，在DDA模式下对50% HCD下的MS/MS碎片进行了单一的分析运行，我们利用MS-DIAL和MS-FINDER软件实现代谢物的结构标注，最小峰值高度的截止值设定为10000幅，质谱匹配的前驱体离子和产物离子搜索窗口的公差分别为0.005 Da和0.025 Da。由于使用了不同的方法进行鉴定，注释化合物根据代谢组学标准倡议(MSI)的置信水平进行分类。
在MSI的第2级，潜在结构利用MS-DIAL结合实验数据库(MoNA)被识别出来。识别分数的截止值设定在80%，在MSI 3级中，暂定结构使用带有计算机内数据库(PubChem，HMDB和LIPID MAPS)的MS-FINDER进行鉴定，公式和结构总分的分界点设定在5.0(满分10分)。在MS / MS光谱与实验数据库和计算机模拟数据库均不匹配的MSI 4级中，我们使用与MSI 3级相同的工具识别了明确的分子式，分子式的截止值设为3.0（总分为5分）。
在11672个MS1信号中，我们在DDA模式下触发了3021个MS/MS谱。其中MSI级2,171个化合物(占全部质谱的5.7%)，MSI级3 853个化合物(占28.2%)，MSI级4 414个化合物(占13.7%)。毛发代谢组被揭示与广泛的化学实体，包括氨基酸，脂类，核苷，核苷酸，有机酸，糖，等等，优化的提取策略和注释工具的结合，为毛发代谢组学研究的研究和应用提供了强大的平台。
7. 局限性
首先，我们使用单因子设计(OFAT)而不是因子设计来寻求研究目的和可用资源之间的战略平衡(完整的因子设计为3×6×5×6 -540个组合)，然而，OFAT认为每个因素都是独立的，并没有同时测试多个因素。由于这些限制，我们无法发现因素之间潜在的相互作用，并可能错过因素的最佳设置。我们没有改变评估的顺序，因此我们的发现的再现性不能保证百分之百。其次，我们承认并不是所有的极性代谢物都被恰当地处理，因为只使用了RPLC，联合RPLC和HILIC可以确保在非靶向代谢组学调查中代谢产物的完全覆盖，然而，之前的研究表明，亲水代谢物不太可能融入头发，使用RPLC可能是一个实际的考虑，以提高分析吞吐量。
结论
头发被认为是一个很有前途的标本，可以记录长期和回顾性的代谢组学数据。虽然目前还不可能通过单一的提取方法来确定完整的头发代谢组，但我们希望通过我们的工作可以缓解这一当代挑战。在本篇文章中，我们建立了针对非目标头发代谢组学的有效提取策略。理想的条件是在+55°C下用甲醇：磷酸盐缓冲液50:50（v / v）进行超声辅助提取240分钟，这种策略可以确保代谢组的真实组成，最大化信号丰度，并保证在一个简单的方法中广泛代谢物的高覆盖率；此外，由于该方法可交付到任何分析实验室，并且样品可以直接用传统的RPLC-MS进行分析，它将明显有利于毛发作为分析样品的研究推广。