科研 | Science：发现一种靶向紧急威胁耐药性真菌的海洋微生物抗真菌药
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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我们迫切需要新的抗真菌药物来解决真菌感染性疾病的出现和跨越大陆的传播，例如具有多重耐药性的念珠菌。利用海洋动物的微生物群和前沿的代谢组学和基因组工具，我们发现了具有体内有效性的抗真菌先导分子turbinmicin，它在体外和小鼠模型中显示出对多重耐药真菌病原体的有效作用，显示出广泛的安全性指数，并通过真菌特异性的作用模式，针对囊泡转运通路的Sec14发挥作用。与其他抗真菌药物疗效、安全性和作用模式的不同使turbinmicin成为一种极具潜力的抗真菌药物先导，以帮助解决全球真菌病原体。
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实验设计
1. 利用MDR药物发现平台从海洋微生物群中发现turbinmicin，并评价turbinmicin结构、形态及化学多样性。
2. 在体外和体内评价turbinmicin对多种MDR真菌病原体和哺乳动物的安全性。
3. MOA假说验证了Sec14p是turbinmicin的主要抗真菌靶点。
实验结果
传染性真菌疾病是全球人类健康最致命的威胁之一，在世界范围内，每年有近200万人死于真菌感染，近年来死亡人数还在继续上升，免疫系统受损的高危人群越来越多，随着对一线抗真菌药物产生耐药性的病原体出现，感染人类的病情也进一步恶化。最近，多重耐药的“杀手真菌” C. auris已经出现并在世界各地的医疗机构中传播，这一情况促使疾病控制和预防中心发出紧急威胁警报。
为了应对耐多药(MDR)病原体的全球威胁，我们迫切需要新的抗真菌药物，而目前，只有三类抗真菌药物可供临床使用。真菌和动物共同的进化史部分阻碍了新型抗真菌药物的开发，由于疗效和/或毒副作用有限，限制了科研人员对药物的治疗选择。大多数抗真菌药物，与其他抗菌先导物一样，来源于天然产物，包括三种可用抗真菌药物中的其中两种，所以，传统的筛选策略已受到严重的挑战，然而最近，在筛选方法和天然产物来源的推动下，以天然产物为基础的筛选又出现了复兴。
为了识别抗真菌候选药物，我们实施了一个利用基于液相色谱-质谱(LC-MS)的代谢组学、基因组学和从海洋动物微生物组细菌分离物代谢组学序列中筛选抗菌活性的发现平台。在这里，我们介绍了一种有前景的抗真菌药——turbinmicin的发现和早期发展，它是从一种海鞘微生物组成分中提取的小单孢菌sp，该化合物在体外和体内表现出抗新型MDR人类真菌病原体的广谱活性，比如金锈菌。Turbinmicin的安全性和高选择性作用机制(MOA)对金曲霉和烟曲霉的作用支持了该化合物的临床应用。
化学多样性对发现计划至关重要，为了建立多样性库，我们对2012年至2016年在佛罗里达群岛收集的1482个海洋无脊椎动物放线菌进行了LC-MS分析。然后，我们使用HCAPCA(层次化聚类分析主成分分析)通过代谢组学应用菌株优先排序，HCAPCA是我们最近发表的基于LC-MS的代谢组学工具(补充材料)，HCAPCA的数据使我们能够对174种不同的化学菌株进行优先排序，如PCA评分图(图1C)，我们从组中分离出菌株WMMC-415，显示化学差异，而主成分分析负荷图(图1D)显示了一些不同的化合物，比如turbinmicin，化合物发酵后我们用两步正交色谱法将分子排列到174个96孔板(补充材料)，通过高通量筛选，我们评估了这些代谢组体阵列对白色念珠菌的体外活性。小单孢菌的成功是基于效力、质谱和核磁共振(见补充材料)而来的，这引出了抗真菌剂的发现，我们命名其为turbinmicin(图1)，turbinmicin属于一小群高氧化型二聚酮类化合物。虽然代表性的药物如放线菌素、溶菌素和黄脂素显示出一系列的生物活性，但没有一个对MOA进行过全面的评估，但其结构的变化会影响活性谱。
我们使用高纯度的turbinmicin进行扩大的、临床相关的体外抗真菌筛选，并通过测定小鼠先天性感染模型的最大耐受剂量(MTD)来评估其有效性和安全性。为了评估turbinmicin的活性谱，我们使用来自临床实验室标准研究所(CLSI M27和M38)的微液法分析了它对39株临床分离菌的活性，该组的临床分离株包括MDR病原菌，代表了常见真菌病原菌(白念珠菌、金耳菌、光念珠菌、热带念珠菌、烟熏假丝酵母、镰刀菌、丝孢菌属和根霉)可用抗真菌类的每一种确定耐药性机制(图2A)。除接合菌属需要4 ~ 8 mg/mL的浓度才能抑制生长外，大多数菌属的甲硝唑浓度范围为0.03 ~ 0.5 mg/mL。Turbinmicin对现有抗真菌类耐药的分离株表现出类似的活性，表明缺乏交叉耐药，并可能具有明显的MOA。我们选择了紫毛孢的泛耐药分离株，进一步对不同浓度的鼻甲霉素随时间的活性进行药效学表征，我们在超过MIC的浓度下观察抗菌活性，在4小时内，最高浓度的微生物负荷下降超过2log(图2B)。
通过人红细胞(RBC)溶血试验和小鼠模型MTD测定，我们初步建立了安全性。超过MIC 1000倍的Turbinmicin浓度没有表现出RBC毒性，这表明该化合物有广阔的治疗窗口(图2C)。为了确定MTD，小鼠被给予单剂量的甲氧苄青霉素从1 mg/kg开始到增加两倍，小鼠在高达256mg /kg的剂量水平上没有显示毒性。接下来，我们使用美国食品和药物管理局(FDA)标准真菌模型研究了侵袭性念珠菌病的体内疗效。在24小时的疗程中，我们给注射了全抗性C. auris菌株(strainB11211)的小鼠注射五剂量的turbinmicin，然后剂量增加两倍，每6小时给药一次(每6小时给0.25到4毫克/公斤)。我们观察到在浓度范围内的剂量依赖效应，与对照组小鼠相比，在最高剂量水平下，受试组机体负荷下降3.6 log10(图2D)，而我们在任何剂量范围内都没有观察到毒性的迹象。人性化的棘皮菌素米卡芬金治疗标准产生了与未治疗对照组相似的结果，正如MDR生物预期的那样,而turbinmicin在这些模型中显示的抗真菌活性与在这些感染模型中的有效性有很好的相关性；真菌负荷(<1 log10)的降低远低于本研究中观察到的，这与对人类的疗效有关。
为了进一步评估turbinmicin的临床应用，我们还评估了它对耐三唑的烟曲霉丝状真菌病原体的疗效表，这种病原体特别难以用现有的抗真菌药物治疗，并很高的致死率(> 50%)。在体内模型中，我们选择了侵袭性肺曲霉病的中性粒细胞和皮质类固醇免疫抑制小鼠模型，通过定量聚合酶链反应(PCR)测定肺真菌负荷来评估治疗反应。在为期4天的疗程中，我们每6小时给感染A. fumigatus的小鼠注射turbinmicin，而在这些研究中，我们根据经验选择了较低的剂量范围(0.25至1 mg/kg)，因为与C. auris相比，A. fumigatus的MIC较低，同样，我们每6小时给予1 mg/kg处理的小鼠肺曲霉菌量下降1.5 log10，turbinmicin也产生了剂量依赖性的真菌负荷下降(图2E)，在4天的疗程中，我们给了小鼠16次turbinmicin，所有小鼠都表现健康，但使用临床推荐的三唑(泊沙康唑)治疗无效，且使用剂量接近人体承受值，与已知的唑耐药一致。
图2 Turbinmicin在体外和体内对多种MDR真菌病原体和哺乳动物安全性显示出强大的效力(A) Turbinmicin对39株真菌的体外抑菌活性。(B) Turbinmicin对C. auris B11211的时间杀伤曲线。杀伤曲线是根据在浓度为MIC的1到16倍的情况下，在吸入turbinmicin后的0、2、4、6、8、24和48小时收集的数据生成的。(C)采用溶血法测定turbinmicin对红细胞的毒性。在所有试验浓度下，turbinmicin均未检测出溶血活性。(D)采用中性粒细胞减少的小鼠播散性念珠菌病模型，用turbinmicin对抗C. auris B11211的体内多剂量实验。多剂量实验中每隔6小时(超过24小时)腹腔注射0.25、0.5、1、2或4 mg/kg的turbinmicin。E)采用肺炎模型进行了turbinmicin对A. fumigatus F11628的体内多剂量实验。
MOA对turbinmicin的查询始于我们对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) DNA条形码敲除和敲低文库的应用。对于必需基因，我们利用mRNA扰动(DAmP)敲低文库(约1000敲低)减少丰度的方法，通过对5 '未翻译区进行修饰，使相应的mRNA转录本失稳，使所有必需基因都被有效敲低。同时，我们评估了turbinmicin在诊断非必需基因突变的DNA条形码敲除文库中的作用，经1 ~ 5 mg/mL的turbinmicin暴露后，我们提取基因组DNA，采用多路PCR扩增其条形码。每个浓度的化学-遗传剖面显示DAmP突变体对turbinmicin最敏感，而SEC14是最值得注意的，在5个测试浓度中的其中3个里，化学-遗传相互作用是最显著的负性(图3A)。Sec14p由SEC14编码的，是一种正确的反式高尔基体网络动力学所需的磷脂酰肌醇-磷脂酰胆碱转移蛋白，它是一种经过验证的真菌靶点，目前批准的抗真菌药物没有以Sec14p为靶点的。
非必要敲除文库支持Sec14p作为turbinmicin的主要靶点之一。ERV14、GUP1和BST1缺失突变体对turbinmicin表现出浓度依赖性的超敏性(图3B)，并且所有编码蛋白都与囊泡介导的运输有关。利用最敏感的非必要缺失突变(CG评分≤−1.5)，我们采用转座子网(TransposeNET)建立了一个遗传交互网络，该算法利用诊断基因集的稀疏数据来填充网络节点，得到的网络显示SEC14是该网络中的一个中心“隐藏”节点(图3C)，统一了DAmP和诊断非必需的化学遗传数据，进一步支持Sec14p作为turbinmicin假定的靶点，我们利用单倍性文库中的C. albicans突变体进行的时间杀伤研究进一步支持Sec14p作为turbinmicin的主要靶点。在SEC14、DOP1、BET5、SUN13和SEC31的基因图谱中，C. albicans缺失突变体(图3D)均显示出相对于野生型C. albicans的超敏反应，这与turbinmicin破坏囊腺介导转运的能力相一致。
为了进一步验证turbinmicin通过抑制Sec14p来削弱囊泡介导的转运的假设，我们使用模型货物蛋白GFP(绿色荧光蛋白)-Snc1直接检测了酵母分泌和内吞途径的膜运输。在指数式生长过程中，GFP-Snc1主要聚集在初生芽的质膜上，而高尔基体和内膜的定位较为温和，然而，在turbinmicin的存在下，GFP-Snc1不再集中在芽中，而是完全与高尔基体和核内体相关(图3E和图S23)，但是细胞极性未受明显影响(图S23)，同样，这些数据与之前的研究一致，Sec14p失活使Snc1定位于高尔基体和核内体。
最后,对接turbinmicin Sec14p产生了主要的磷脂结合口袋绑定模式，turbinmicin七环的环系统重叠co-crystallized配体的位置picolinamide (6F0E)、β-octylglucoside (1AUA)和turbinmicin多烯的尾巴扩展成一个疏水裂空co-crystallized配体(图S24)。这一观察结果与实验结果一致，在实验中，turbinmicin侧链的裂解(通过水解)降低了抗真菌活性(见补充材料)，与化学基因组学、单倍性和膜转运分析一样，这些硅片研究暗示Sec14p作为turbinmicin开发的主要真菌，是其MOA的基础。
讨论
世界卫生组织和美国疾病控制和预防中心最近的报告强调，正在出现的抗菌素耐药性目前和预计产生的影响将会是一场公共卫生危机，美国疾病控制与预防中心首次将真菌病原体C. auris列为最高优先级的紧急风险，而抗真菌药物发展的一个主要挑战是建立其对人体的安全性和逃避或阻止耐药机制的能力，例如棘白菌素，尽管其有效性和安全性良好，但在本质上容易产生与隐球菌有机体相关的耐药机制；这种易感性是一个主要的限制，它强调了改进方法的必要性。两性霉素和偶氮化合物都有其特点，但都受到毒性问题的限制；偶氮唑，它们对特异性CYP450酶的亲和性受到来自药物-药物相互作用的毒性的限制。探究turbinmicin的潜在毒性的研究是必要的，迄今为止，老鼠模型的结果都比较理想，我们的数据暗示Sec14p是turbinmicin的主要抗真菌靶点；潜在的脱靶效应似乎是有限的，并且没有下游毒性。我们会密切注意监测与真菌病患者治疗相似的更长期治疗的副作用(通常为2至6周)，以及在进一步发展为人类使用之前，对其他动物物种进行研究。
结论
我们的结果表明，动物微生物群落具有细菌多样性，很容易转化为生物合成基因簇(BGCs)形式的化学多样性，这些生物合成基因簇编码以前未测试过的天然产物支架，这种支架可以使用MOAs来对抗不同于目前药物的微生物病原体，Turbinmicin以其高度官能化的多环核和亲脂侧链，似乎构成了这样一个支架。与turbinmicin相关的BGC类是罕见的，考虑到我们现在对进化选择的微生物群和生态系统以及尖端应用方法的了解，Turbinmicin的治疗潜力证明了微生物源作为发现的信标的持续重要性。抗真菌的体外和体内活性，哺乳动物的安全性，以及Sec14p作为靶点的开发前景，都为turbinmicin作为抗真菌先导物的进一步临床前开发提供了依据。