编译：傻狍子，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
土壤真菌群落是由复杂多样的真菌群落组成的，其中包括功能多样的物种，从植物病原体到互助性生物。其中，向植物提供磷(P)的丛枝菌根真菌(AMF)。虽然已知植物寄主和非生物参数来构造AMF群落，但对于包括原生生物和线虫在内的高级营养生物如何影响AMF丰度和群落组成，仍有很大程度上的未知。
本文探讨了AMF，真菌性原生生物和线虫之间的联系，这些联系可以部分反映营养的相互作用，并在长期施用肥料的情况下将其与根际磷动力学和植物性能联系起来。我们的结果表明，粪肥的添加增加了AMF的生物量和真菌性线虫的密度，并调整了AMF，真菌性原生生物和线虫的群落结构。我们发现，在高肥料处理下，优势真菌性线虫Aphelenchoides和Aphhelenchus消化的AMF含量高于无肥料和低肥料处理。结构方程建模与网络分析相结合表明，真菌性原生生物和线虫的捕食刺激了AMF生物量并改变了AMF群落组成。菌根-真菌相互作用促进了玉米根系中AMF的定殖和P转运蛋白基因ZMPht1; 6的表达水平，从而提高了植物的生产力。研究突出了捕食作为塑造AMF组成和增强AMF生物量的关键要素的重要性，从而提高了植物的生长性能。因此，我们阐明了AMF，真菌性原生生物和线虫之间在驱动磷吸收和植物生长中的复杂相互作用的新生物学机制。
原名：Trophic interactions as determinants of the arbuscular mycorrhizal fungal community with cascading plant-promoting consequences
译名：营养相互作用是丛枝菌根真菌群落促进植物产量的决定性因素
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2020.10
通讯作者：蒋瑀霁
作者单位：中国科学院土壤研究所
本文在中国江西省中科院气象站（28°15′20′′N，116°55′30′′E）进行试验。实验地点为典型的亚热带气候，年平均气温为17.6°C，降雨量为1795 mm。。长期野外实验遵循了完全随机的设计，包括三个重复。该实验从2002年开始进行，由12个混凝土地块组成，其大小如下：长2 m，宽2 m和深1.5 m。四种肥料处理方法是：（1）无肥料（M0）；（2）150 kg N ha-1 years-1（M1）的低粪肥；（3）600 kg N ha-1years-1（M2）的高肥料；（4）600 kg N ha-1 years-1的高粪肥和3000 kg Ca（OH）2 ha-1 3years-1（M3）的石灰。该田每年4月至7月进行玉米单一栽培（Suyu No. 24）。每个小区都种植了20株玉米。除人工除草外，未采取任何管理措施。在2018年7月下旬收获后，采集土壤样本，以分析土壤理化性质、AMF群落、真菌食性原生生物和线虫组合等数据。包括测量了土壤pH、SOM含量、总氮含量、酸性和碱性磷酸单酯酶的活性等指标。用中性脂质脂肪酸(NLFA)和磷脂脂肪酸(PLFA)分别对AMF和腐殖质真菌的生物量进行了分析。提取土壤DNA并在Illumina MiSeq平台上进行文库制备、聚类和300 bp的配对末端测序。使用微生物生态学定量分析对原始序列进行质量筛选和裁剪。选择完全匹配条形码的序列，并进行序列处理，包括质量修剪、解多路复用和分类学分配。然后，对每个样本读取的序列进行聚类，得到基于相似性的操作分类单元(OTUs)，其识别界限为97%。最后，分别使用MaarjAM AMF数据库和原生核糖体参考数据库对序列进行相似性搜索。将所有样本纯化到相同的测序深度后，计算AMF、食性原生生物和线虫群落的Alpha多样性和Bray-Curtis距离作为主坐标分析。根据原生生物的摄食习性对其功能单位进行了分类。在收获后立即测定了玉米的茎部生物量、根系生物量和籽粒产量。使用桌面扫描器处理了根系形态的数字图像，并使用WinRhizo软件确定了根系长度、表面积、平均直径、根系体积以及尖、叉和交叉的数量。从新鲜土壤中提取线虫。根据已知的捕食习性、气孔和食道形态/，确定了线虫的四大功能类群。在解剖显微镜下，根据形态特征分别将两种食性线虫(Aphelenchoides和Aphelenchus)放入10mm的无菌磷酸盐缓冲液(ph7.0)中。将收获的线虫放入2%的次氯酸钠溶液中30秒，以避免机体表面的微生物干扰，然后用无菌蒸馏水清洗5次。将最终洗涤水中的AMF孢子通过湿筛和蔗糖梯度离心进行分离和枚举，并对18S rRNA基因拷贝数显示的AMF丰度进行量化。若没有检测到AMF孢子和AMF丰度，表明线虫已被表面灭菌。使用试剂盒按照说明书提取表面灭菌的线虫的总DNA。利用上述相同引物，通过基因拷贝数来评估食性线虫体内AMF丰度。分别以每个线虫的AMF 18S rRNA拷贝数计算线虫体内的AMF丰度。最后采用SPSS 23.0软件评估肥料处理对土壤特性、AMF群落、真菌食性原生生物和线虫的组合、植物性能的影响。利用主坐标分析(PCoA)评价了有机肥处理下AMF及线虫群落组成的Bray-Curtis距离。利用R语言计算了以计算PCoA的Bray-Curtis距离。并通过共现网络(CoNet)推断计算多重相关性和相似性构建一个相关矩阵来描述菌根-真菌网络中复杂的共现模式。最后进行了随机森林工具定量评估了AMF定植的重要预测因子以及包含土壤特性，AMF群落和真菌组合的P转运蛋白基因的表达。基于随机森林分析，进一步选择了重要的预测变量以进行结构方程模型（SEM）分析。
1. 土壤性质和磷酸酶活性
单向方差分析表明，粪便处理改变了土壤的化学性质（p<0.05）。与低肥（M1）和无肥（M0）相比，高肥（M2和M3）处理的特征在于土壤pH，土壤有机质（SOM），总氮（TN）和总磷（TP）显着提高（p<0.001）。同样，通过高肥施用，有效磷（AP），硝酸盐氮（NO3-N）和土壤水分（SWC）显着提高（p<0.01）。施肥处理之间总钾（TK，P=0.317），有效钾（AK，P=0.768）和铵态氮（NH4-N，P=0.932）没有显着差异。碱性磷酸单酯酶活性随粪肥添加量的增加而增加（p<0.01）。M1处理具有最高的酸性磷酸单酯酶活性，而M2和M3处理该活性水平最低。
2. 植物生长，根系形态和P转运蛋白
粪肥处理对根系形态有显着影响（p<0.001），因此根系干生物量，根系长度，投影面积，表面积，平均直径，根系体积表现出M3≥M2>M1>M0的总体趋势。研究发现植物生产力的趋势相同，包括芽生物量，根生物量和玉米籽粒产量（图1）。与M0处理相比，M2和M3处理通过AMF显着增加了根定植频率（p <0.001，图1）。与M0处理相比，M2和M3下P转运蛋白基因ZmPht1; 6的表达上调了3.0和2.7倍。但是，PHT1家族的饥饿诱导型P转运蛋白（ZMPht1; 3）表现出相反的表达模式（p<0.01）（图1）。
图1 肥料处理后根际植物的生长，根系形态和磷转运体。a工厂生产力。b丛枝菌根真菌（AMF）的根定植频率。c PHT1家族中P转运蛋白基因（ZmPht1; 3和ZmPht1; 6）的表达。植物生产力为根，茎和谷物生物量的总和。d，e玉米根中AM真菌菌丝和囊泡，放大倍数为100倍。f，g在玉米根中放大400倍的AM真菌丛枝。Tukey的HSD测试表明，小写字母不同的长条（n = 3）表明存在显着差异（P <0.05）。M0，无肥料M1，低肥料；M2，高肥料；M3，高肥加石灰。通过NLFA和PLFA分析，我们确定了根际中AMF和腐生真菌的生物量。平均而言，腐生真菌的生物量是AMF生物量的3.1倍（p<0.0001）。M2和M3处理的AMF和腐生真菌的生物量是M0处理的3.3-4.6倍和2.6-3.1倍（图2）。用于研究AMF多样性的Illumina测序表明，在M2和M3处理下，香农维纳指数和Chao1丰富度明显高于M0处理，但低于M1处理（图2）。在所有样本中，AMF群落优势属由Glomus（47.6％），Rhizophagus（17.8％），Paralglomus（8.0％），Gigaspora（7.5％），Ambispora（7.4％）和Acaulospora（5.0％）组成。稀有的菌属由Archaeospora（1.5％），Scutellospora（1.2％），Geosiphon（1.1％）和Diversispora（0.11％）（图2）。通过主坐标分析对AMF群落组成的分析表明，四种肥料处理之间存在显着（p<0.01）的差异性。与M0处理相比，粪肥处理的Ambispora，Glomus和Paraglomus的丰度明显更大，而Acaulospora，Gigaspora和Rhizophagus呈现相反的趋势（p<0.05）。在高肥料处理下，AMF与植物生物量的比例明显低于M0和M1处理。PERMANOVA指出，粪肥处理可解释AMF群落组成变化的三分之二（67.8％）（p<0.001）。AMF群落的生物量和组成与AMF定植频率，碱性磷酸酶活性和ZmPht1;6基因的表达呈正相关。
图2 粪肥处理下根际的丛枝菌根真菌（AMF）和腐生真菌群落。a AMF生物质。b 腐生真菌生物质。c 多样性。d AMF群落结构组成。Tukey的HSD测试表明，小写字母不同的长条（n = 3）表明存在显着差异（P <0.05）。NLFA，中性脂质脂肪酸；PLFA，磷脂脂肪酸。M0，无肥料；M1，低肥料；M2，高肥料；M3，高肥加石灰
对于根际上的真菌性原生生物，PCoA和PERMANOVA结果表明，群落组成是通过粪肥处理决定的。总体而言，在真菌性原生生物中，Grossglockneriidae（31.1％）占主导地位（图3）。主要的兼性真菌属是Cercomonas(43.7%)和Acanthamoeba（10.3％），累计占已鉴定的潜在真菌性原生生物的54％（图3）。在高粪肥处理下，Grossglockneriidae的相对丰度在所有生物和真菌的相对比例大大超过了M0和M1处理。与真菌性原生动物相似，PERMANOVA与PCoA结合使用后表明，粪便处理导致真菌性线虫的种类不同。在真菌性线虫中，线虫属中的Aphelenchus菌属（61.9％）和Aphelenchoides菌属（19.1％）是线虫组合中两个最丰富的。M2和M3处理下的真菌线虫的密度比M0处理下高3.3-4.6倍，这主要是由于占主导地位的甲虫（3.0-6.2-fold）和细骨线虫（3.8-5.5-fold）的增加所致。与M0处理相比，线虫对所有线虫的相对比例以及线虫对植物生物量的比例在粪肥处理显着减少（图3）。值得注意的是，与M0处理（16.3±2.6和2.6和2.6）相比，在M2处理（每个线虫为48.9±5.6和349.1±45.9拷贝）和M3（每个线虫为35.8±1.3和268.2±19.5拷贝）时，Aphelenchoides和Aphelenchus中的AMF丰度明显更高（图4）。真菌性原生生物（Cryptodifflugia, Grossglockneriidae和Leptomyxa）和线虫（Aphelenchoides和Aphelenchus）与AMF群落的生物量和组成以及腐养真菌的生物量显着相关。
图3 粪肥处理下根际的真菌性原生生物和线虫的组合。Grossglockneriidae相对于所有生物的相对比例（a）和真菌对所有生物的相对比例（b），真菌性原生生物的组合（c），真菌性线虫的密度（d），真菌对所有线虫的相对比例（e）和真菌线虫的集合体（f）。Tukey的HSD测试表明，小写字母不同的长条（n = 3）表明存在显着差异（p<0.05）。M0，无肥料；M1，低肥料；M2，高肥料；M3，高肥加石灰
图4 两种优势真菌线虫Aphelenchoides（a，b）和Aphelenchus（c，d）体内的AMF丰度。 a和c，放大200倍。 Aphelenchoides和Aphelenchus内部的AMF丰度分别表示为每个线虫的AMF 18S rRNA基因的拷贝数。 Tukey的HSD测试显示，小写字母不同的长条（n = 3）表明存在显着差异（P <0.05）。 M0，无肥料； M1，低肥料； M2，高肥料； M3，高肥加石灰5.土壤特性，AMF和真菌性原生动物和线虫共同介导的P有效性和根系P转运蛋白基因在共生网络中，AMF，噬菌体生物和真菌性线虫被聚集成四个不同的模块（图5）。模块I，II和IV由63、42和31个节点组成，分别涉及AMF，真菌性原生生物和线虫，而模块III包含21个仅来自AMF的微生物。模块II和IV正相关性（411和69个边）明显高于负相关性（0和5个边）。但是，与模块II和IV相比，模块I中负相关（73个边）与正相关（92个边）的比率增加了。模块I，II和IV与土壤化学性质呈正相关，包括SOM，TN，TP，AP，SWC和NO3-N（r = 0.61-0.98，p<0.05）。此外，这三个模块与碱性磷酸酶活性（r = 0.83-0.94，p<0.001），AMF定植频率（r = 0.86-0.98，p <0.001）和AM特异性P转运蛋白基因ZmPht1; 6基因的表达呈正相关（r = 0.87-0.93，p<0.001），而不是酸性磷酸酶活性（p> 0.05）。随机森林模型表明，土壤pH（p<0.05），SOM（p<0.05），TN（p<0.01）和TP（p<0.01）是AMF定植和ZmPht1; 6基因的土壤非生物变量中的主要预测因子。至于生物变量，AMF定居和ZmPht1; 6基因表达的变化受AMF群落的生物量和组成（p<0.01）以及真菌性原生生物和线虫的组合的显着影响（p<0.05）。结构方程模型（SEM）进一步预测，AMF的定殖和ZmPht1; 6基因的表达直接受到AMF群落的影响，而间接受到真菌性原虫和线虫的聚集的影响（图6）。与AMF群落相比，菌根-真菌网络对AMF定植的贡献虽然较弱，但与ZmPht1; 6基因的表达和植物生产力之间存在显着的间接关系。
图5 根际土壤的共现网络显示出强而显着的相关性。网络由AMF /原生动物/线虫类群（a）和模块（b）着色，分别列出了所有真菌性原生动物和线虫。模块I-IV代表具有紧密互连的节点的四个群集。每个节点的大小与连接数（度）成正比，两个节点之间的每个连接（边缘）的厚度与相关系数的值成正比。蓝色线表示正相关，红色线表示负相关。c，模块本征基因，土壤特性，AMF定植，ZMPht1; 6基因的表达和植物生产力之间的相关系数。粗体值表示重要关系。SOM，土壤有机质；SWC，土壤含水量；TN，总氮； TP，总磷；TK，总钾；NH4-N，氨氮；NO3-N，硝酸盐氮；AP，有效磷；AK，有效钾。 *** p <0.001； ** p <0.01； * p <0.05。在粪肥修正下对pH，SOM，TN和TP的修饰可通过增强AMF孢子萌发和生长速率来促进AMF根定植。有机肥可提高AMF的丰度并塑造群落，从而促进AMF与植物之间的共生。菌根的存在可以通过加速有机肥的转化来促进植物养分的获取。在自然和农业土壤中，尤其是Glomus在粪便处理中AMF属增加了。Glomus可以有效地获取N和P。整个AMF群落变化可以介导磷的循环速率并促进植物体内磷的利用率。AM诱导的P转运蛋白（ZMPht1; 6）的上调暗示在高肥施用下可能从直接吸收向菌根依赖性P吸收转移。据报道，共生中的AMF会诱导植物Pht1转运蛋白并转换为菌根依赖的P吸收。因此，我们的结果表明，在增加肥料施用量的情况下，土壤养分，AMF和植物定植之间存在正向联系。磷吸收的这些级联效应可能对植物生物量和农作物产量产生积极影响。在所有土壤中都存在专性的和潜在兼性的真菌性线虫和线虫，它们与真菌群落的变化有关，至少部分是通过增加AMF的丰度和塑造AMF的群落组成来实现的（图6）。原生动物和线虫被认为是重要的自上而下的真菌群落结构元素，这里的观点特别适用于AMF。我们观察到，随着粪肥投入的增加，AMF与植物生产力的比率以及真菌与植物生产力的比率均显着降低，这表明AMF和真菌性线虫群落的变化与粪便添加对植物的影响无关。在高粪肥处理中，两个主要的真菌性线虫（Aphelenchoides和Aphelenchus）内部的AMF含量显着升高（图4），为线虫在AMF上捕食提供了经验证据。确实，AMF和腐养真菌的菌丝体和孢子可以被线虫真菌捕食。特定于物种的选择性捕食可能会影响相关AMF群落的生物量和结构，以及腐生真菌的生物量。例如，一种特殊的喂养结构可使专性真菌Grossglockneriidae穿孔菌丝，从而专门捕食形成菌丝的真菌。兼性真菌包括Cercomonas和Leptomyxa可以消耗酵母阶段和真菌的孢子。以真菌为食的线虫属Aphelenchoides和Aphelenchus与Glomus菌丝体繁殖，并可能促进外部菌丝的发育。Aphelenchus由于较高的进食速度，可能比Aphelenchoides对AMF产生更强烈的积极影响（图4）。在同现网络中，AMF，原生生物和线虫之间的密切关系意味着通过直接和间接的营养相互作用而形成复杂的联系。AMF与真菌之间的正相关关系表明，在真菌原生动物和线虫的捕食下，孢子的萌发和根际AMF生长增加。捕食对AMF菌丝发育的积极影响可能部分归因于回收被锁定在衰老真菌组织中的矿物质并在孢子中提供高脂质含量。另一个可能的解释是，通过优先以AMF群落的非活性部分或/和竞争性非AMF物种为食，真菌性线虫和线虫的存在对AMF的生物量和活性产生了累加的积极影响。但是，我们承认AMF和真菌之间的联系是双向的，而不是单向的。由于已证明真菌会直接捕食真菌以维持其生存，因此确实由真菌决定了原生动物和线虫的密度。
我们认为真菌性原生生物和线虫通过改变根际AMF群落的功能来调节有益的植物-AMF相互作用（图6）。这与经典观点相反，经典观点认为，原生生物和线虫在真菌中的重要性不如在细菌能量通道中重要。一些研究支持这可能是一个误解，因为真菌性原生生物的生物量可以等于细菌性原生生物的生物量，并且许多以前建议的细菌性原生生物实际上也以真菌为食。然而，一些研究支持这可能是一个误解，因为真菌性原生生物的生物量可以等于细菌性原生生物的生物量，并且许多以前建议的细菌性原生生物实际上也以真菌为食。AMF诱导形成大的土壤聚集体，这为粪肥处理下的真菌生存和捕食提供了更合适的微生境。AMF，原生生物和线虫之间的紧密联系表明，土壤食物网中存在着具有许多联系的复杂群落结构。特别是，在我们的网络分析中，AMF和特殊功能模块中的真菌之间的关联可能有助于增加AMF定植和植物生长。捕食者可以通过消耗效应影响猎物的数量和活动，这表明捕食者可以回收固定化的营养以控制猎物的功能。此外，真菌性原生生物和线虫还促进了土壤碱性磷酸酶活性，这与新鲜有机肥料的矿化作用有关，并通过在AMF群落中捕食而循环利用了磷的动力学机制，以提高宿主营养的利用率。这可能是由于营养相互作用造成的，从而加速了土壤磷的溶解过程，根系磷的吸收和植物的生产力。我们无法完全评估自上而下的捕食会影响AMF社区的单向链接，因为自下而上的链接也可能有助于观察到的模式。考虑到整个土壤微生物组，真菌，AMF和植物之间积极相互作用的潜在机制仍需要进一步的机理研究。
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