科研 | Science signaling：小鼠大脑肽组动态变化揭示益生菌对肠-脑轴 的调节
人体肠道包含一个复杂的微生物群落，人们日益认识到它们是调节宿主生理，代谢和免疫力的重要因素。越来越多的证据表明，肠道菌群与许多神经系统过程有关，包括神经传递，神经发生，神经炎症和神经内分泌信号传导。尽管已经确定了肠脑轴的重要作用，但其潜在机制仍不清楚。益生菌是对宿主具有健康益处的活微生物。尽管许多报告表明了益生菌的有益效果以及微生物组，肠道和大脑之间的联系，但要阐明其基本机制仍然是一项挑战，这主要是由于缺乏对该复杂系统的深入分子知识。神经肽和肽激素是多种类型的生物调节剂。它们在中枢神经系统中高度丰富，并参与大多数生理和心理过程，包括生殖，进食，能量稳态，疼痛，记忆，情绪，焦虑，奖励途径，唤醒和睡眠觉醒周期。
鉴于脑肽的调节作用的重要性以及脑肠轴上的先前发现，本研究试图探索
（i）施用益生菌是否可以改变脑肽组，
（ii）脑肽组和肠道微生物组是否相关。
本研究描述了肽组在多个脑区的动态分布，通过在不同时间口服不同的益生菌物种进行调节。脑肽组的时空和菌株特异性变化与肠道微生物组的组成相关。海马对益生菌处理表现出最敏感的反应。给予热灭活益生菌改变了海马肽组，但没有实质性改变肠道微生物组。此外还开发了一种文献挖掘算法，将益生菌改变的神经肽与潜在的功能作用联系起来。通过监测下丘脑-垂体-肾上腺轴验证了促肾上腺皮质激素释放激素的益生菌调节作用，益生菌治疗可减弱产前应激诱导的肾上腺轴功能亢进。该发现为益生菌调节脑肽组提供了证据，并为进一步研究肠-脑轴和益生菌治疗提供了资源。
论文ID
原名：A dynamic mouse peptidome landscape reveals probiotic modulation of the gut-brain axis
译名：小鼠大脑肽组动态变化揭示益生菌对肠-脑轴的调节
期刊：Science signaling
IF：6.467
发表时间：2020.07
通信作者：邵晨&金锋&贾辰熙
通信作者单位：国家蛋白质科学中心&北京蛋白质组研究中心&北京生命组学研究所&中科院心理研究所
实验设计
为了系统研究肠道菌群对脑肽的影响，对7组成年C57BL/6J雄性小鼠进行了4种不同的1个月干预方案和3种不同的2个月干预方案（图1A）。1个月的干预方案包括小鼠分组喂食白开水、含益生菌L.helveticus NS8的水、含热灭活NS8的水、L.fermentum NS9混合的水，以下分别称为C、NS8、NS8h或NS9处理。2个月给药方案包括仅给予白开水（CC）、用NS8饮水1个月后再给予白开水1个月（NS8C）或用NS8饮水2个月（NS8NS8）。动物安乐死后，通过基于MS的肽组学分析跨越4个脑区（下丘脑、海马、纹状体和垂体）的内源性肽，通过16S rRNA测序评估肠道微生物组（图1A）。该实验设计将治疗的效果分为几个可变因素，包括不同的益生菌菌株、治疗时间和脑区以及活的与热灭活的益生菌。本研究建立了一个“1小时肽组学”工作流程（图1B），能够通过单次运行液相色谱-串联MS（LC-MS/MS）从微小的小鼠下丘脑中鉴定出2598个修饰特异性肽（一个肽包含特定的修饰类型和位点），包括神经肽、肽类激素和其他内源性肽。使用质量准确性、置信度评分、可重复性和定量准确性等因素证明使用该方法的定量结果可信程度。
图1 实验设计和整合肽组学工作流程。（A）7组小鼠（每组n=12只）分别用白开水（C）、瑞士乳杆菌NS8（NS8）、发酵乳杆菌NS9（NS9）或热灭活NS8（NS8h）处理1或2个月，如图所示。治疗后，检测各组肠道微生物组组成（16S rRNA测序）和脑肽组学。每个组学数据集的n值显示在该数据集符号旁边。数据分析时，将各组所有数据合并。由于样本制备或数据采集失败，一些组学集中数据的n值小于每项实验中的动物数量（n=12）。C，1个月对照；NS8，1个月NS8处理；NS8h，1个月热灭活NS8处理；NS9，1个月NS9处理；CC，2个月对照；NS8C，1个月NS8处理和1个月未处理；NS8NS8，2个月NS8处理。（B）深入分析脑肽的整合工作流程。
结果
1 一小时肽组学能够准确、快速地分析脑肽
通过对C组数据集的12只小鼠进行分析，进一步将1小时肽组学方法作为跨越多个脑区的基准，分别从下丘脑、海马、纹状体和垂体中鉴定出2290、1162、1262和4620个修饰特异性肽（图2A）。垂体含有数量最多的内源性肽，丰度的动态范围也最高。结果还表明，一些肽在不同区域表现出高度动态的表达。例如，神经肽Y（NPY）在海马、下丘脑和纹状体中的丰度排在前30位，但在垂体中的丰度排在较低水平。此外，绘制了下丘脑中肽的累积丰度（图2B），并总结了这些多肽中前75%所代表的家族（图2C）。其中有6个多肽占总累积量的前25%，其中3个的功能研究较多，即little-SAAS、big-LEN和生长抑素-28（1-12）（图2B）。总的来说，1小时的肽组学方法能够对脑肽进行高通量分析，并产生了一个大脑区域-可解析的资源，总共有6315个鉴定出的修饰特异性肽。
2 益生菌治疗诱导脑肽组重塑
为了评价益生菌治疗的效果，对NS8组和C组之间的肽组学数据进行了无标记定量分析。治疗后，发现2230个可定量脑肽（独特序列）中有366个丰度有明显变化，肽强度和计数信息如直方图所示（图2D，左）。可定量肽的一些C-和N-末端线性序列motifs表现出神经肽的特征，二碱基裂解位点KR或单碱基裂解位点R（图2E，左），这与神经肽酶加工的裂解规则一致。除了来源于前激素的神经肽外，还有数千个来源于非前激素蛋白的内源性肽，这些肽也包含在LC-MS/MS数据中。为了比较神经肽和其他内源性肽对益生菌治疗的反应敏感性，通过去除激素原蛋白构建了基于UniProt小鼠蛋白条目的定制数据库，然后使用LC-MS/MS数据对该数据库进行定量分析。获得了一组没有富集motifs的非激素原肽（图2E，右），这与先前关于大鼠脑肽的报告相似。肽强度和计数信息的直方图（图2D）显示，促激素衍生肽组对益生菌治疗的反应变化率高于非促激素衍生肽组。这一结果表明，作为重要信号分子的神经肽比非促激素肽对益生菌治疗的反应更敏感。此外，计算了由于益生菌处理在三种类型的生物分子上改变肽的百分比，包括（i）SwePep数据库中的肽，（ii）最长的肽派生型（LPV），和（iii）在碱性残基裂解位点产生的神经肽（-1、+1和+2位的K/R）。这三类生物分子表现出更多的神经肽富集特征，其变化率远高于非激素原肽（图2F）。
上述结果揭示了益生菌治疗引起神经肽的显著变化，对治疗反应的敏感性取决于调节分子的类型。
图2 以益生菌给药后1小时肽组学方法和肽组变化为基准。（A）给予白开水1个月的对照动物（C组）基于4个脑区肽强度的脑肽动态范围。记录了一些肽的值。（B）C组下丘脑中肽的累积丰度从最高到最低。箱形图插图显示了益生菌处理诱导的生长抑素-28（1-12）丰度的变化。（C）C组动物下丘脑中前75%的神经肽（按累积强度）所属的家族。（D）直方图，显示NS8给药1个月后与未给药1个月（NS8/C）（包括前激素衍生肽[左]和非前激素衍生肽[右]）相比下丘脑中可定量且显著改变的肽。（E）Logo图显示了（D）和数据文件S2中可定量肽对应的末端区域侧翼肽中存在的基序。（F）与对照组相比，NS8诱导的神经肽衍生肽变化速率。CCK，胆囊收缩素；NP，神经肽；LPV，最长肽变体。
3 肠道微生物组评估揭示与大脑肽组的潜在相互作用
为了查找脑肽通过肠-脑轴变化的可能原因，通过分析C组、NS8组和NS8h组的16S rRNA数据集来研究肠道微生物组。在所有的组别中，小鼠微生物组主要为拟杆菌门和厚壁菌门。尽管通过α-多样性分析没有显著的组间差异，但β-多样性的主坐标分析（PCoA）表明，NS8组与C组和NS8h组的差异大于C组和NS8h组的差异（图3A，左）。与C组相比，NS8h组在肠道微生物组中没有表现出统计学上的显著变化。接下来对来自下丘脑和海马的肽组数据集开展了主成分分析（PCA）（图3A，中间和右侧）。在下丘脑中，观察到肽组的变化趋势与微生物组相似。只有活的NS8处理引起脑肽组的变化，热灭活的NS8处理没有。此外，还观察到脑区特异性效应。在海马肽的PCA图中，NS8组和NS8h组均与C组分离，表明热灭活和活NS8处理改变了海马肽组。
本研究注释的115个细菌属中，属于毛螺菌科和瘤胃球菌科的4个属经NS8处理后发生了显著改变（图3B）。以往的报道显示，这两个科的改变与多发性硬化症、抑郁症和孤独症相关。随后，选择了4个显著改变的细菌属，[Eubacterium] xylanophilum group、Anaerotruncus、Ruminiclostridium 5和Ruminococcaceae UCG-013，对所有样本的肽组数据集进行Spearman相关性分析（图3C）。其中，血管活性肠肽（VIP）与Anaerotruncus的丰度呈明显相关性（图3D）。VIP是一种由28个氨基酸组成的肽，与Ⅱ类异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体结合，在能量代谢和昼夜节律的调节中起重要作用。Anaerotruncus是瘤胃球菌科的细菌属，也与能量代谢有关。这些结果表明这些细菌属和脑肽之间可能通过肠-脑轴进行调节。
观察到活的NS8的治疗引起了肠道微生物组和下丘脑肽组的显著的、相关的变化（图3A、3B）。这表明微生物组组成的改变是益生菌调节脑肽的可能途径。为了研究与微生物组变化相关的肽，将那些只在NS8组中改变的肽聚为一类（图3E），然后将其分组为神经肽家族（图3F）。颗粒素、阿片类药物、proSAAS、生长抑素（SMS）和F&Y酰胺的排名靠前，表明这些肽组对肠道菌群变化发挥潜在功能。此外，NS8h组表现出与C组不同的肽丰度模式（图3E）。
图3 益生菌NS8和热灭活NS8治疗1个月后脑肽组和肠道微生物组变化的相关性。（A）与对照动物相比，使用活的（NS8）或热灭活的（NS8h）NS8处理1个月后，肠道微生物组的PCoA图和下丘脑和髋关节肽组的PCA图（对照）。（B）C、CS8和NS8h组中4个细菌属的相对丰度。（C）热图显示了下丘脑中显著改变的细菌属和代表性脑肽的Spearman相关系数（r）矩阵。（D）散点图显示血管活性肠肽（VIP）的丰度与肠道微生物组中Anaerotruncus相对丰度之间的关系。（E）下丘脑肽组C、NS8h和NS8治疗组变化的分层聚类。（F）仅在NS8组发生改变的下丘脑肽组的神经肽家族。
4 益生菌治疗后的脑肽变化显示区域特异性模式
为了提供益生菌治疗后脑肽表达谱的总览，汇总了神经肽所属家族的肽组学信息，并进一步将其聚为跨越四个脑区的圆形肽图（图4A）。垂体中的肽主要由颗粒素和阿片类家族组成，这两种家族在其他三个脑区中的丰度较低。通过计算每个家族中肽变化的百分比（图4B），下丘脑中可卡因和苯丙胺调节的转录本家族显示变化率为33%。
为了比较分析不同脑区对益生菌治疗的反应，评估了脑肽的两个可定量值：变化率（改变与可定量肽数的比值）和倍数变化。NS8治疗组与C组（NS8/C）4个脑区比较的定量肽组学数据聚集成直方图显示肽计数与强度（图4C）。将脑肽增加或减少的倍数变化进一步总结成箱形图（图4C）。海马中的肽显示出最高的变化率（33%），也显示出最高的增加量，表明其在研究的4个区域中反应最敏感。相比之下，纹状体中多肽的变化率极小，下降的多肽倍数变化最小。在一定程度上，NS8处理抑制了纹状体中一些肽的表达。
接下来，研究了脑肽在多个区域的共定位和共调节。将NS8/C的肽组学数据总结成多面板、区域分辨条形图（图4D）。73%的已鉴定肽仅在单个区域表达，几乎99%丰度增加的肽和96%丰度降低的肽均在单个区域显示特异性分布。随后，使用C组和NS8组的数据集对不同脑区的脑肽和肠道细菌属的变化进行了Spearman相关性分析。与4个细菌属相关的代表性肽，包括在食欲调节中具有功能的神经肽（图4E、4F），神经肽包括厌食肽α-促黑素细胞激素（α-MSH）、β-MSH、神经调节素-B和生长抑素-28（1-12），以及厌食肽NPY和食欲素。此外，VIP和神经调节素-B在两个脑区表现出相似的相关模式。肠道细菌和脑肽之间的相关性表明两者之间可能存在一种调节关系。
图4 NS8治疗组与对照组动物的局部脑分布和多肽的变化。（A）圆形脑肽组图描述了对照（C组）动物肽组中的定性、定量和区域特异性信息。外环表示神经肽家族；中4环是大脑4个区域脑肽的定性信息；内4环是4个脑区各自的定量信息。（B）热图显示了与对照小鼠相比，NS8处理小鼠中脑肽家族的变化率（家族中改变/可定量的肽）。（C）直方图说明了与C组相比，NS8处理小鼠的4个脑区中发生改变的可定量脑肽。箱形图显示了改变的脑肽（修饰特异性肽）的倍数变化。（D）条形图显示了每个脑区中鉴定、增加或减少的肽数量。图下的矩阵中记录了存在于多个区域（共定位）或在多个区域（共定位）丰度显示相似变化的肽子集。饼图总结了在一个、两个、三个或所有四个脑区共同调节的脑肽的百分比。（E）热图显示了跨越4个脑区的显著改变的细菌属和代表性脑肽的Spearman相关系数矩阵。（F）散点图显示了神经肽Y（NPY）和食欲素-B的丰度与肠道微生物组中[Eubacterium] xylanophilum group和Anaerotruncus之间的关系。
5 多种因素驱动下丘脑肽组的重塑
为生成7个实验组脑肽变化的全局视图，通过PCA处理下丘脑肽组学数据，并在三元图中绘制各组的中心值（图5A）。CC组与C组明显分离，表明小鼠年龄对脑肽也有影响。1个月治疗组NS8与1个月对照组C沿不同方向分离，然后2个月治疗组NS8NS8因年龄和NS8治疗的综合作用而进一步与NS8分离。此外，NS9和NS8h组分别通过不同益生菌菌株和活菌与热灭活菌的作用与C组向不同方向分离。这些结果说明了各种处理条件下肽组重塑的动态格局，这也提出了以下问题：（i）益生菌处理的肽变化是否具有时间依赖性；（ii）年龄对成年小鼠肽变化的影响程度；（iii）益生菌菌株之间的差异是否导致肽变化的不同表型。
为了回答第一个问题，将NS8/C和NS8NS8/CC的肽组数据集绘制成双层火山图（图5B）。2个月治疗结果显示比1个月治疗组更显著的变化，表明益生菌诱导的肽组变化取决于治疗持续时间。为了回答第二个问题，对C组和CC组的肽组学数据进行了差异分析。每项实验终点时成年小鼠之间的年龄相差1个月是29%变化率的原因，远高于NS8处理导致的16%变化率（图2F）。这一结果表明动物发育和年龄是益生菌治疗对脑肽变化影响的一个不可忽视的因素。为了回答第三个问题，对C组、NS8组和NS9组的微生物组进行了PCoA分析和肽组的PCA分析（图5C）。L helveticus NS8和L helveticus NS9是乳酸杆菌的不同菌种，并通过不同的代谢机制对宿主发挥不同的益处。从肠道微生物组数据的PCoA分析（图5C），发现NS9治疗引起的肠道微生物组的变化比NS8治疗小得多。在下丘脑肽组的PCA分析中也观察到类似的效应。随后，对肽组学数据进行了分层聚类，结果表明菌株特异性效应导致的治疗对肽的变化具有相同和相反的趋势。
图5 不同治疗条件下下丘脑肽的变化。（A）C、NS8、NS8h、NS9、CC、NS8C和NS8NS8 7个实验组脑肽组变化的三元PCA图。彩色箭头表示成对比较可以识别益生菌处理特定变化、不同益生菌菌株、动物之间1月龄差异、活益生菌与热灭活益生菌以及用活NS8处理1个月的恢复的处理组。（B）与仅用水对照（NS8/C和NS8NS8/CC）相比，NS8处理1个月和2个月的脑肽改变的Volcano图。（C）C、NS8和NS9组肠道微生物组的PCoA图和下丘脑肽组的PCA图。（D）筛选曲线显示假定的益生菌改变的肽，与对照组相比，NS8处理增加（红色）或减少（绿色）。CRH用蓝色突出显示。（E）在6种指定条件下对CRH丰度进行斑点印迹验证。（F）1个月（NS8）和2个月（NS8NS8）NS8治疗方案后代表性神经肽丰度相对于所示对照组的变化。
6 益生菌改变的脑肽表现出相似的变化模式
为了筛选益生菌改变的脑肽的候选物，选择了在不同处理条件下以某些模式改变的肽。假设益生菌处理改变的一个肽会遵循肽筛选图中显示的趋势之一（图1B），那么热灭活的益生菌将不如活的益生菌有效。对于在处理的第一个月表现出益生菌依赖性增加的多肽，丰度在处理的第二个月会继续增加，仅在白开水处理的第二个月会下降（图1B）。同样，在处理的第一个月期间，肽的丰度应表现出益生菌依赖性降低的镜像趋势——在处理的第二个月持续降低，并仅在随后的补充白开水的月份增加。需要注意的是，由于益生菌处理，多肽可以表现出不同的变化趋势，如在处理的第一个月内增加或减少，在白开水上再放置一个月后其丰度可能出现没有继续变化或逆转其丰度的变化的情况。
通过使用这种筛选策略，获得了71个肽候选物，它们在下丘脑内遵循肽筛选图中定义的趋势（图1B、5D），包括研究较多的神经肽促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的增加（图5D、5E）。这种CRH的增加可能是由对益生菌治疗的免疫应答诱导的。除了遵循建立的聚类规则的多肽（图5D），许多具有重要报道功能的神经肽仅在NS8治疗第2个月后表现出变化（图5F），包括催产素在内。此前，Buffington等人发现罗伊乳杆菌可逆转高脂饮食雌鼠所生小鼠后代的社会缺陷，并提出了罗伊乳杆菌通过增加催产素和相关功能改善社会行为。本研究中，这些功能分子的动态变化表明长期益生菌治疗可能改变生理过程和行为。
7 文献挖掘揭示了益生菌改变的神经肽的功能作用
本研究构建了一种称为MINIbar（挖掘神经肽及其相关行为）的算法策略来挖掘PubMed，用于查找益生菌治疗丰度改变的神经肽的功能作用和行为（图6A）。通过支持每种关联的出版物数量，改变神经肽的五种治疗条件与可能的相关生理过程和行为相吻合（图6B）。例如，2个月的NS8治疗确定了12种与焦虑和抑郁高度相关的神经肽的变化，374篇出版物证明了这一点（图6B）。这一结果与之前报道的NS8改善应激诱导的焦虑和抑郁样行为一致。此外，摄食量、社会和生殖行为以及睡眠-觉醒和昼夜节律周期也与益生菌治疗改变的神经肽相关（图6B）。这些基于文献的结果提供了NS8改变肽与表型行为相关的证据，也提示了NS8的潜在应用。
图6 应用MINIbar算法挖掘已发表摘要中特定神经肽相关行为的文本。（A）显示如何挖掘PubMed摘要以识别益生菌治疗改变的特定神经肽调节的生理过程和行为的示意图。（B）雷达图显示益生菌治疗和从出版物挖掘预测的行为之间可能的联系。根据报告神经肽对行为调节作用的出版物数量，5种益生菌治疗条件与6种行为相关。
8 NS8治疗可减轻产前应激引起的CRH和促肾上腺皮质激素的升高
为了探索益生菌诱导的CRH增加的功能（图5D、5E），研究了益生菌对产前应激诱导的CRH和促肾上腺皮质激素（ACTH）的影响。临床研究报告表明，妊娠期间女性暴露于丙戊酸（VPA）可增加其后代患孤独症的风险，啮齿类动物在子宫内暴露于VPA是一种成熟的孤独症模型。为了研究VPA暴露和益生菌治疗对后代CRH和ACTH级联反应的影响，进行了第二组动物实验，包括4组后代。雌性小鼠在妊娠期间接受VPA治疗，然后将其后代小鼠分为两组。一组用NS8治疗1个月（VNS8#2组），另一组不治疗（V#2组）。同时，将未接受VPA治疗（益生菌治疗和不治疗）的两组雌性后代作为对照（分别为NS8#2和C#2组）。对所有4组的下丘脑和垂体肽的分析显示，与C#2组相比，V#2组下丘脑中CRH的丰度增加，但VNS8#2组中增加的量减少（图7A）。垂体中的ACTH遵循相同的趋势（图7B）。免疫印迹支持肽组分析的结果（图7A、7B）。这些数据表明，宫内VPA暴露影响了CRH和ACTH信号级联反应，产后益生菌治疗可减弱这种影响，结果证明CRH也能被NS8改变。因此，通过本研究的方法筛选的其他肽（图5D）值得进一步深入分析，以阐明它们与益生菌的联系，以及益生菌影响这些神经肽调节的行为或生理功能的潜力。
图7 监测产前应激和NS8治疗后HPA轴脑肽变化。（A）柱状散点图显示了未治疗母本的对照（C#2，n=12）和NS8治疗（NS8#2，n=12）后代下丘脑中CRH的肽组强度，以及VPA治疗母本的对照（V#2，n=6）和NS8治疗（VNS8#2，n=6）后代下丘脑中CRH的肽组强度。下图显示了从指定小鼠下丘脑提取的肽中CRH的斑点印迹。印迹代表使用来自三种不同小鼠的样本进行的独立实验。（B）柱状散点图显示了未治疗母本的对照（C#2，n=7）和NS8治疗（NS8#2，n=5）后代垂体中ACTH的肽组强度，以及VPA治疗母本的对照（V#2，n=6）和NS8治疗（VNS8#2，n=5）后代下丘脑中ACTH的肽组强度。下图显示了从指定小鼠下丘脑提取的肽中ACTH的斑点印迹。印迹代表使用来自三种不同小鼠的样本进行的独立实验。
讨论
已有研究揭示了肠道和大脑之间存在相互交流，益生菌对神经系统的功能和宿主行为具有有益的影响。神经肽是一类与大多数生理过程相关的多样化信号分子。在此，本研究就益生菌给药对脑肽组的影响进行了深入分析。研究表明，大脑肽组被益生菌菌株重构，这与肠道微生物组的变化相关。综合脑肽组数据集说明了这些生物分子在肠-脑轴中可能具有重要作用。
神经肽是总脑肽的主要成分，由前激素（前体蛋白）通过一系列酶裂解步骤生成。一种前激素可能产生许多具有不同活性和功能的成熟神经肽。尽管转录组学和蛋白质组学方法可对生物分子进行大规模分析，但分析能力和规模仅分别在转录本和前激素水平上准确，而对具有生物活性的成熟神经肽的精确度较低。相比之下，肽组学方法可以直接分析内源性神经肽，从而能够检测起始肽序列的翻译后修饰，更准确地反映生理性激素前体的加工过程。本研究建立了一个1小时的肽组学方法来准确和快速地分析大样本，其实用性和效率通过基准数据集的高质量来证明。以往的报道表明，某些生理和环境的变化（如昼夜节律、一天中的时间和高盐或高脂饮食）调节脑肽的产生。在这项研究中，这些可变因素已经被最小化，益生菌给药是改变对照组和益生菌治疗组之间脑肽的主要因素。到目前为止，还没有发表针对肠-脑轴的大规模脑蛋白质组学研究。Chen等人报道，肠道微生物组和大脑代谢组在整个寿命中是相关的，并建立了双层策略来分析相关性。除了代谢物和神经肽，一系列生物活性分子，如蛋白质、RNA、脂质和其他也同样值得研究，以此获得其在肠-脑轴中调节作用的新见解。
本研究观察到一些种类的肠道细菌和脑肽之间存在显著相关性。该菌属于毛螺菌科和瘤胃球菌科，是与能量代谢和体重调节相关的两个优势细菌科。Gomez-Arango等人研究了超重和肥胖孕妇肠道微生物组与代谢激素的关系，发现毛螺菌科和瘤胃球菌科与脂肪因子密切相关。肠道微生物组中这两种细菌家族相对丰度降低与长期体重增加相关。在肥胖小鼠体内定植一种毛螺菌科细菌可促进糖尿病的发生。本研究结果表明，许多神经肽与这两个细菌家族相关，包括血管活性肠肽（VIP）、食欲素-B、神经肽Y（NPY）、α-黑色素刺激激素（α-MSH）、神经调节素-B和生长抑素-28。这些神经肽大多参与能量平衡和食物摄入的调节，在文献挖掘中，涉及食物摄入和相关生理过程的出版物在这些益生菌改变的神经肽中排名最高。未来的研究应该关注了解肠道微生物通过调节神经肽改变这些过程的分子机制。
本研究中另一个重要发现是，热灭活益生菌处理引起了海马肽组谱的显著变化。热处理和无活性的益生菌被称为副益生菌。这些副益生菌含有像肽聚糖片段和DNA这样的活性成分，可以调节免疫功能，由于其更容易储存并具有更长的产品保质期等优点，因而适用于治疗产品的商业开发。Ou等报道热灭活乳酸菌可通过转换免疫反应增强免疫调节能力。本研究结果发现，热灭活NS8处理在属水平上没有显著变化，PCoA分析也没有显著分离，这表明热灭活NS8没有改变微生物组组成。总的来说，本实验结果提供了肽水平的证据，热灭活益生菌可以影响肠-脑轴，而不影响肠道微生物组的组成。
该研究团队以前的报道表明，NS8治疗改善了慢性束缚应激诱导的大鼠行为和认知障碍，而NS9给药恢复了抗生素诱导的心理畸变。在本研究中，观察到两种益生菌L.helveticus NS8和L.fermentum NS9（都属于乳杆菌家族）表现出调节脑肽组的菌株特异性效应。益生菌的机制和作用具有菌株特异性已被公认，即每种菌株均表现出特定的健康益处。Buffington等人报道罗伊乳杆菌治疗可恢复小鼠的社交缺陷，但约氏乳杆菌没有影响。Wall等人评价了短双歧杆菌菌株NCIMB 702258和DPC 6330给药对小鼠大脑中脂肪酸组成的影响，发现最显著改变的脂肪酸花生四烯酸和二十二碳六烯酸在神经发生和神经传递中发挥重要作用。在本研究中，给予NS8和NS9导致肠道微生物组和脑肽组发生明显变化。揭示了菌株特异性效应的肽水平特征，这可能是不同益生菌菌株提供不同有益和治疗后果的原因之一。
本研究为支持益生菌可以改变大脑肽组提供了有力的证据。有学者提出，益生菌可能会改变微生物群组成或直接调节参与肠道和大脑对话的通路，包括宿主的免疫系统、迷走神经和/或代谢物。前一种模型涉及通过微生物-肠-脑轴的调节，而后者涉及通过肠-脑轴的直接作用。本研究结果表明，益生菌可以通过两种机制调节脑肽组。活的NS8改变了肠道菌群，但热灭活的NS8治疗改变了大脑肽组，而没有改变肠道微生物组，证明可能是通过肠-脑轴的直接作用。此外，肠道细菌的几个属也与特定的脑肽高度相关。因此，益生菌给药可能通过肠-脑轴和微生物-肠-脑轴改变脑肽组。
有许多肠肽激素参与肠-脑轴的调节。肠道微生物增加释放胰高血糖素样肽1（GLP1）和肽YY（PYY）的肠内分泌L细胞的增殖，两者均起食欲调节作用。此外，肠道微生物生成短链脂肪酸，刺激GLP-1和PYY的分泌。这些肽类激素进入循环系统，影响大脑。在这项研究鉴定出的脑肽中，其中一些也是在肠道中产生的。一个例子是VIP，它在许多器官中产生，包括大脑和肠道，本研究结果中，下丘脑中的这种肽与厌氧菌表现出显著的相关性。表明微生物可能直接与肠道细胞相互作用，促进进入循环并传播至大脑，也可能间接调节大脑中VIP的产生。具体机制是否通过该设想还需要进一步的研究来确定。
总之，本研究揭示了口服益生菌可以通过肠-脑轴改变脑肽组，脑肽组与肠道微生物组的组成相关。本研究提供了跨越不同脑区、治疗时间和益生菌菌株以及副益生菌的动态肽组谱。总的来说，这些信息丰富的数据集描绘了与肠道细菌以及相关生理过程和行为相关的脑肽，证明了本研究提出的1小时的肽组学方法阐明肠-脑轴的分子机制和突出益生菌治疗潜力的力量。