科研 | LDD：沿海农业生态系统中土壤特征和细菌群落对氮肥添加梯度的响应(国人作品)
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在受盐分影响的环境中理解施肥和土壤细菌群落之间的关系对于缓解过多的土壤盐分对土壤生物化学功能的负面影响是必要的。然而，在沿海农业生态系统中土壤细菌群落如何响应连续的氮肥梯度还没有弄清楚。在本研究中，在沿海受盐影响的土壤中进行了连续三年的4种氮肥梯度（0，150，300和450 kg N hm-2 y-1）的野外样方实验。对土壤化学和物理属性的时间动态进行了表征，并且使用16S rRNA基因测序研究了在不同的氮肥速率中土壤细菌群落的组成。结果表明，连续施氮显著增加了土壤有机碳（SOC），总氮（TN），有效氮（AN），有效磷（AP），微生物生物量碳（MBC），微生物生物量氮（MBN）以及净氮矿化速率（NMR）。施氮速率和栽培年限对TN，AN，MBC和NMR有交互作用。土壤细菌群落丰富度和多样性随着氮速率增加。优势的细菌纲是Deltaproteobacteria，Anaerolineae，Alphaproteobacteria，Betaproteobacteri，Gammaproteobacteria，Actinobacteria 和Planctomycetia。施氮量的增加导致Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Planctomycetia和Nitrospira纲的相对丰度增加，和Anaerolineae，Acidobacteria_Gp6，Cytophagia，Bacilli和Acidobacteria_Gp10的相对丰度减少。Alphaproteobacteria，Planctomycetia，Nitrospira的群落组成与潜在的硝化速率（PNR）显著关联，然而Actinobacteria的与碳矿化速率（CMR）显著关联。结果表明，施氮改善了滨海农业生态系统的养分、生化特性和代谢活性，使其更适合于微生物生境。
论文ID
原名：Response of soil characteristics and bacterial communities to nitrogen fertilization gradients in a coastal salt-affected agroecosystem
译名：在沿海受盐影响的农业生态系统中土壤特征和细菌群落对氮肥添加梯度的响应
期刊：Land Degradation & Development
IF：3.775
发表时间：2020.07
通信作者：王相平，杨劲松
通信作者单位：中国科学院土壤科学研究所土壤与农业可持续国家重点实验室
实验设计
实验研究地点位于中国江苏省，东台地区（32°49.9′ ~ 32°50.3′N, 120°56.6′ ~ 120°57.4′E），条子泥开垦区域（图1）。研究地点位于海洋-陆地交接区域，并且在2013年围海造地。
图1 条子泥开垦区域和实验地点的地理位置。
本研究使用随机区组的实验设计，在4个重复的区组中包括4个处理。每个区组中每个样方的大小为3 x 4米，相邻的样方用50厘米宽，30厘米高的隆分隔开。四个处理包括对照（CK，不添加氮肥），NF1（施150 kg N ha-2 year-1的氮肥），NF2（施300 kg N ha-2 year-1的氮肥）和NF3（施450 kg N ha-2 year-1的氮肥）。在实验之前，2250 kg ha-2 的过磷酸钙添加到样方中，因为在受盐影响的海岸线区域土壤中磷比较缺乏。在实验期间氮肥以尿素（含有46.4%的氮）的形式添加。在播种之前，人工的将肥料与土壤表层0-15厘米的土壤层混合，在作物生长季的时候，肥料通过喷洒的方式添加。
野外样方在2015年5月建立。在2016年6月，2017年6月初和2018年6月初分别进行野外取样，即在冬小麦收获之后水稻播种之前。使用5厘米直径的钻取3钻核心土后混合均匀作为一份样品。在每次取样中总共有16份混合的样品。
每个样方内的土壤样品分成三份子样品：第一份风干，磨碎并且过1 mm 或0.15 mm筛用于土壤物理化学属性分析，第二份过2 mm 筛并且储藏在4℃，用于土壤微生物分析，第三份过2 mm筛并且储藏在-80℃，用于土壤DNA的提取，扩增和测序。分析的土壤物理化学属性包括土壤盐分（ECe），pH，砂（SA）和粘土（CA）的颗粒含量，土壤有机碳（SOC），容重（ρb），盐离子交换能力（CEC），总氮（TN），有效氮（AN）和有效磷（AP）。土壤微生物属性包括微生物生物量碳（MBC），微生物生物量氮（MBN），碳矿化速率（CMR），净氮矿化速率（NMR）和潜在的硝化速率（PNR），因为这些指标与土壤微生物的群落组成，丰度和活性紧密相连。
根据试剂盒提取土壤微生物DNA。使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ® ND-2000c紫外可见分光光度计测定提取DNA的质量和纯度。提取的DNA稀释到10 ng μL -1 并储藏在-80℃用于后续的分析。
在中国上海Genesky Biotechnologies Inc.进行细菌16S rRNA基因扩增和Miseq文库的建立。对16S rRNA基因的V4-V5高变区进行扩增。使用GoTaq® Hot Start PCRMaster Mix进行聚合酶链式反应，即25 uL的反应体系。使用ABI2720 Thermal Cycler，循环条件为：在94℃进行3 min的初始变性步骤，随后再94℃（45 s）循环35次，在50℃（30 s）退火，在70℃（90 s）延伸并且在72℃延伸10 min。使用AmpureXPbeads去除非特定的PCR产物，对PCR产物进行纯化。使用Agilent 2100bioanalyzer instrument对平均分子长度进行确定。通过实时定量PCR对文库进行定量。在Illuminia MiSeq Benchtop Sequencer对定量的库进行测序。使用QIIME v1.7.0进行下游序列分析的实施。使用PANDAseq 对成对的读数进行组装，使用USEARCH v7对组装序列进行质量过滤，仅仅保留长度大于100碱基的序列。在实施过滤步骤后，总共收集了4790305条序列，平均长度为376个碱基。在97%的相似水平上对序列进行可操作单元的聚类（OTUs）。分类信息分配到OTUs并且样品稀释到10000个序列，校正不同测序深度带来的差异。
结果
1 土壤化学和微生物属性
表三呈现了每个施氮速率中土壤化学和微生物属性的统计比较。对于对照处理（CK），SOC，AP，MBC，MBN，CMR，NMR和PNR分别增加了65.3%，188.4%，66.8%，36.9%，21.0%，39.1%和36.8%，然而ECe，TN和AN分别减少了73.4%，18.6%和15.1%。施氮处理中SOC、TN、AN、MBC、MBN、CMR、NMR和PRN呈上升趋势，增幅分别为77.6-82.7%、1.0-65.8%、4.5-20.9%、95.4-174.6%、58.8-100.9%、36.7-82.9%、63.6-158.3%和45.5-75.7%。土壤ECe下降了67.1-71.4%。单因素方差分析结果表明，在各栽培年份，随着施氮量的增加，TN、AN、MBC、MBN、NMR呈显著增加趋势，与土壤氮素形态及转化密切相关。各施氮处理的pH、SOC、CEC、AP、MBC、MBN、CMR、NMR和PNR均随栽培年限的增加而增加，而ECe则呈下降趋势。单因素方差分析结果显示，不同施氮量与栽培年限之间存在不一致性，说明应考虑氮肥与栽培年限的相互作用。所有处理组的两因素方差分析显著性水平如表3所示。施氮速率对SOC、TN、AN、AP、MBC、MBN和NMR的影响统计显著，表明施氮速率的增加会提高以上指标。栽培年数对ECe、pH、SOC、CEC、TN、AP、MBC、MBN、CMR、NMR和PNR有显著影响。此外，施氮速率和栽培年限对TN、AN、MBC和NMR有显著的交互作用，表明施氮速率对这些土壤属性的影响在不同的栽培年限中表现不同。有趣的是TN、MBC和NMR受栽培年限和施氮速率的直接影响以及交互影响。
土壤化学和微生物属性的皮尔森相关系数在表4中呈现。土壤ECe与SOC、CEC、AP、MBC、MBN、CMR、NMR和PNR负相关。SOC与ECE、TN、AN、AP、MBC、MBN、NMR和PNR正相关。pH与其他土壤属性不显著相关。CMR与大多数土壤属性相关，包括ECe、SOC、CEC、TN、AN、AP、MBC、MBN、NMR和PNR。土壤微生物特性与土壤化学性质的相关性表明，土壤碳、氮的转化和代谢易受土壤环境因子的影响。
2 测序数据的描述和细菌丰富度和多样性
序列的范围在187097到395864，每个样本的平均序列为299394，从不同的施氮处理中获得的16个土壤样品总共获得了4790305条高质量的序列。用于分析的序列平均长度为376个碱基，用于分析的序列大约80%在门水平，45-50%的序列能在纲水平，仅仅30-35%的序列能在属水平，进行分类。
图2呈现了根据16S rRNA基因扩增序列计算的细菌群落丰富度和多样性指标。与对照土壤样品进行比较，在150，300和450 kg N hm-2 yr-1速率的处理中，OTUs分别增加了3.67%、8.14%和15.05%。基于物种丰富度的alpha多样性在样本中不同。Chao1和ACE，群落丰富度指数，随着施氮速率增加，在NF3（450 kg N hm-2 yr-1）处理中的样本的Chao1和ACE指数显著高于CK和NF1（150 kg N hm-2 yr-1）中的。OTUs/Chao1的平均比值为83.27% ± 1.86%，说明测序工作并不彻底。香浓指数与盖度指数呈现类似的趋势，即随着施氮速率增加，然而辛普森指数随着施氮速率降低。基于丰富度和多样性指数的样本比较展现了细菌群落组成对施氮速率的响应，最高的细菌丰富度发生在NF3和NF2处理中，其次是NF1和对照处理。
3 在门和纲水平上的细菌的群落组成
在门水平上一共鉴定出了36个细菌门并进行了分类。在所有样本中占优势的门是：Acidobacteria, Actinobacteria,Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes,Gemmatimonadetes, Ignavibacteriae, Nitrospirae, Planctomycetes,Proteobacteria 和Verrucomicrobia（相对丰度大于0.5%）。在分析的土壤样品中优势的分类群是：Proteobacteria (39.17%), Chloroflexi (15.81%), Acidobacteria (7.19%), Actinobacteria(6.34%), Planctomycetes (5.82%)，其次是第二组，在所有样本中的分布比例较低但仍然很重要，即Bacteroidetes (4.44%), Firmicutes (1.98%), Gemmatimonadetes (1.53%), Ignavibacteriae(1.51%)。分布相对较低的分类群是Cyanobacteria (0.99%), Nitrospirae (0.95%) 和 Verrucomicrobia (0.70%)。在门水平上，细菌群落丰度的相对丰度在图3a中呈现。对于对照处理，Proteobacteria占总的土壤细菌的36.53%，然而在NF1，NF2，和NF3处理中其百分比分别增加到39.29%，39.42%和40.78%。Cloroflexi，另一个优势门，在土壤对照处理中占总的细菌的17.12%，在NF1，NF2和NF3处理中分别占17.58%，15.30%和13.57%。当考虑所有处理时也发现Firmicutes和Nitrospirae相对丰度的转变。
图3 在所有处理中不同的细菌类群在门（a）和纲（b）水平的相对丰度。
图3b在纲水平上显示了细菌群落的相对丰度。在所有的土壤样品中总共分类出来的有73个，其中23个纲的相对丰度大于0.5%。在所有的样品中优势纲（相对丰度大于5%）包括Deltaproteobacteria (11.79%), Anaerolineae(10.61%),Alphaproteobacteria (10.27%), Betaproteobacteria (7.94%), Gammaproteobacteria(7.41%), Actinobacteria (6.13%) 和 Planctomycetia (5.15%)。一些细菌纲较低但是很重要（相对丰度在1%到5%之间）包括Acidobacteria_Gp6 (2.65%), Ignavibacteria(1.49%), Cytophagia (1.43%), Sphingobacteriia (1.33%), Nitrospira(1.32%), Gemmatimonadetes (1.20%), Bacilli (1.19%) 和 Acidobacteria_Gp10 (1.05%)。在群落水平细菌群落相对丰度在表5中呈现。Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria,Planctomycetia和Nitrospira随着施氮速率有增加的趋势。施氮减少了Anaerolineae, Acidobacteria_Gp6,Cytophagia, Bacilli和Acidobacteria_Gp10的相对丰度。在不同的施氮处理中Deltaproteobacteria, Betaproteobacteria,Actinobacteria, Ignavibacteria, Sphingobacteriia 和Gemmatimonadetes的相对丰度没有显著差异，表明施氮对以上细菌纲没有显著影响。
4 在不同的氮速率中细菌纲的差异
采用主坐标分析法（PCoA）分析了不同施肥量处理的分化程度。在纲水平，在不同是施氮梯度下，PCoA证明了细菌群落清楚的分离（图4）。第一主成分（PC1，40.7%的贡献率），解释了数据的大量变异，呈现了是否施氮。第二主成分（PC2），代表着施氮速率，解释了数据17.9%的变异。总共，两个主成分能解释58.6%物种变异。两个组成成分通过不同的施氮速率将群落组成分开，不同的施氮速率是处理间唯一的不同。显而易见的，在300 kg N ha-1y-1的一个土壤样品在150 kg N ha-1y-1的处理组中聚集。尽管这样，PCoA的结果表明土壤细菌纲能从不同的施氮速率中分开，并且施氮速率的变化会带来群落组成的改变。
图4 在不同的施氮速率中土壤样品在纲水平上的细菌群落主坐标分析（PCoA）。
16种优势细菌纲的相似性和差异性在细菌群落热图中进一步呈现（图5）聚类分析表明，样品中主要有四个类群，它们具有独特的组成和丰度。对照土壤样品与其他施氮处理的样品是有区别的，表明细菌群落组成在是否施氮处理中有明确区分。速率为450 kg N ha-2y-1的样品也很容易区分，例如Alphaproteobacteria, Anaerolineae和 Actinobacteria，然而150 kg N ha-2y-1和300 kg N ha-2y-1处理之间的差异不明显。事实上，大多数类群虽然显示出不同的丰度，但随着N速率的增加，它们似乎聚集在一起并均匀分布在所有样本中。说明氮肥在形成细菌群落中没有土壤盐分重要。表5中相对丰度的分析也能也能证明这一点。
图5 不同施氮速率的土壤样品中细菌纲频率分布热图。
5 细菌群落组成的冗余分析
采用冗余分析方法（RDA）研究了土壤特性对不同处理间细菌群落组成和纲类群相对丰度的影响。土壤属性包括SOC，TN，AN，MBC，MBN，CMR，NMR和PNR，然而ECe，pH，CEC和AP没有包括其中，因为在所有的土壤样品中这些变量没有显著差异。图6呈现了在纲水平基于细菌群落数据矩阵的RDA检验的环境-物种关系。第一轴解释了37.8%的变异，与CMR，PNR和TN相关。表明第一轴在某种程度上能刻画土壤碳和氮的新陈代谢。第二轴解释了12%的变异，与SOC，MBC，MBN，AN和NMR相关。第二轴代表着土壤碳和氮含量的状态。TN是与细菌群落纲的分布关系最强的因子。CMR也与群落组成显著相关，然而其他因子不显著。Alphaproteobacteria, Planctomycetia和Nitrospira的群落组成显著受PNR的影响，Acitinobacteria的群落组成显著受CMR的影响。此外，SOC，MBC，MBN和AN对Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria和 Bacteroidia的群落组成也有显著影响。
图6 不同氮速率的土壤中土壤特征与细菌群落组成的冗余分析（RDA）。
6 施氮速率和优势纲之间的关系
使用相关分析检验了氮梯度对优势细菌纲相对丰度的影响（图7）。施氮速率与Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria和Nitrospira显著正相关，表明这些细菌纲的相对丰度随着施氮速率增加。氮梯度与Cytophagia和Bacilli显著负相关，表明随着施氮速率的增加会导致这些细菌纲的相对丰度减少。
图7 优势细菌纲相对丰富与施氮速率之间的关系。
讨论
1 土壤化学和微生物属性对栽培和施氮的响应
在沿海盐影响的区域栽培和施肥会影响大多数的土壤化学和微生物属性（表3），这与Yao et al (2013) 短期研究的结果一致，例如翻耕和施肥对土壤有机质，养分储存，ECe，和碱性有显著影响。土壤化学和微生物属性的改变主要归因于土壤ECe的降低，其降低是由于水稻-冬季小麦的轮种导致（表4）。之前大多数研究报道了土壤盐分在沙漠或者沿海生态系统中是土壤微生物群落的关键决定因子，并且土壤有机体，有效养分，微生物多样性，生物量和新陈代谢随着盐分梯度的增加而降低。其原因在于土壤盐分的降低抑制了土壤团聚体的解体、氨挥发、氮素淋失和土壤有机碳矿化，而增加了土壤微生物的丰度、活性和碳氮同化潜力。
在受盐分影响的环境中，施肥在提高土壤化学和微生物属性方面也扮演着重要的角色，这对于土壤有机质和养分的转化和循环是重要的。长期的生态学实验表明土壤属性和细菌新陈代谢对施氮有高度的响应，并且土壤微生物特性的构建更多的取决于氮的有效性，而不是与氮输入增加有关的植物群落和土壤pH的改变（Ramirez et al., 2010）。这与本研究一致，氮输入的增加对土壤物理化学属性和微生物属性有一致的影响，例如SOC，TN，AN，AP，MBC，MBN和NMR（表4）。在受盐影响和不受盐影响的土壤环境中，氮肥会通过改变优势细菌类群和增加微生物活性影响土壤微生物属性这点是显而易见的，例如土壤呼吸，碳和氮同化，通过生物化学过程也会导致土壤物理化学属性的变化。在一个更严格的研究中，Dong et al., (2015) 报道了土壤生物量和酶活对氮有响应，但是响应取决于氮添加的量，并且联合添加氮和磷促进了土壤肥力和微生物活性。事实上，氮输入的增加，增加了微生物生物量氮固定并伴随着更多氮的释放，并且显著提高了土壤微生物生物量N的大小和微生物施肥对土壤微生物量N的回收率。这与我们的研究结果一致，高剂量的氮添加增加了微生物生物量N和氮矿化速率并且导致了更高的土壤总氮和有效氮的含量。
2 在受盐分影响和不同的施氮速率的环境中优势细菌门和纲
基于荟萃分析和从GeneBank和RDP两个数据库获得的序列，90%的细菌序列来自于6个门，包括Proteobactera，Actinobacteria，Firmicutes，Acidobacteria，Bacteroidetes和Chloroflexi (Ma and Gong, 2013)。类似地，在泥滩和水稻土壤中Proteobactera，Bacteroidetes，Chloroflexi，Acidobacteria和Proteobactera是观测到频率最高的优势细菌门。以上细菌门在本研究中也能发现，尽管这些门和不同处理间的绝对和相对群落丰富度和多样性各不相同（图2和3）。实际上，以上优势细菌门在很多研究中都有报道。此外，除了以上与土壤盐分相关的细菌门，一些门在非盐的土壤中也广泛分布，在本研究中也能发现，包括Gemmatimonadetes，Ignavibacteriae，Cyanobacteria/Chloroplast，Nitrospirae，Verrucomicrobia和Armatimonadete。施氮速率对Gemmatimonadetes和Nitrospirae有显著的正向影响，对Armatimonadete有显著的负向影响，然而其它细菌门在所有的样地呈现平等的分配。一般而言，氮肥在形成细菌群落能力不如土壤盐分。Chen et al. (2017) 也发现施肥能改变土壤细菌群落并且缓解盐分对土壤微生物新陈代谢的负面影响。
在纲水平，超过总的细菌丰富度的60%属于7个纲：Deltaproteobacteria，Anaerolineae，Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Actinobacteria和Planctomycetia。Proteobacteria门的四个纲Deltaproteobacteria，Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria是优势细菌纲，并且占总的细菌丰富度的37.5%（表5）。在盐影响的土壤环境中，Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria的相对丰度随着盐分而增加，然而Betaproteobacteria随着盐分降低（Bello-López et al., 2014）。就丰度而言，Yousuf 等（2014）也发现在高盐度的土壤或者水中Alphaproteobacteria是优势类群，然而Betaproteobacteria在非盐的土壤中更重要，而Gammaproteobacteria只占很小一部分。这也与Kirchman 等（2004）的结果一致，他发现在海洋系统中Alphaproteobacteria和类-Cytophage细菌占优势，然而Betaproteobacteria在淡水系统中是优势类群。在受盐分影响的土壤中当考虑不同的施氮速率时，占优势的类群中两个类群显著增加（Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria），5个类群没有响应（Deltaproteobacteria，Anaerolineae，Betaproteobacteria，Actinobacteria和Planctomycetia）。当考虑百分比较低但是重要的细菌纲时，一个纲（Nitrospira）显著增加，两个降低（Cytophagia和Bacilli）（图5和7）。本研究的结果也有与之前的报道存在一些不一致。基于长期施氮（8-27年）实验，Ramirez 等（2010）发现Gammaproteobacteria和Actinobacteria随着氮输入增加，并且不同施氮年限细菌多样性的响应在不一致的。Fierer 等（2006）提出了一个假说，即碳输入的数量和质量可以解释观察到的细菌群落组成在氮梯度上的变化。事实上，大多数先前的研究表明，农田管理措施，包括灌溉、土地利用和秸秆还田，对整个微生物群落的影响大于施肥。Guo 等（2018）和Sun 等（2018）的结果证明，在不同施氮水平的微咸水灌溉条件下，细菌组成无显著差异。可能的解释是，细菌群落组成对土壤水分、盐分和碳的输入比施氮量更为敏感，在土壤水分、盐分、有机碳等非限制因素且基本同质的地区，氮输入占优势。
3 细菌群落组成和土壤化学和微生物特征之间的关系
土壤细菌群落组成通过适应能力好的物种取代适应能力差的物种改变，这是群落特征分布变化的主要机理之一。土壤细菌群落组成的转变是土壤化学和物理属性的改变的直接影响，这种改变与不同的施氮速率相关联，而与施氮量不一致的组分变化更可能是与施氮量协同变化的间接因素的结果。有趣的是，Anaerolineae属于碳水化合物和酚类降解菌，其相对丰度与大多数土壤化学和微生物性质呈负相关（图6）。这与Zhang 等（2019b）的研究结果不同，在海岸受盐分影响的泥滩Anaerolineae的相对丰度随着水稻种植年限的增加而增加。在本研究中高剂量的氮输入和较低的有机质可能导致较低的碳氮比，因为Anaerolineae在厌氧的条件下时有机质重要的分解者，所以Anaerolineae的丰富度降低。本研究赞成Zhang 等（2019b）的研究结果，即Anaerolineae的相对丰度随着氮输入的增加降低8.1%-22.7%。Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对丰度与大多数土壤化学和微生物属性正向关联。这与Iwaoka 等（2018）的结果一致，他的结果表明Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对丰度与总氮和净氮矿化正相关。在本研究中，在土壤氮循环中扮演重要角色的Planctomycetia和Nitrospira与大多数土壤属性正相关（图6）尤其是Nitrospira纲。在它们当中，Planctomycetia利用和转运铵，Nitrospira作为自氧的亚硝酸盐氧化菌在硝化过程中扮演重要角色（Daims and Wagner, 2018）。在本研究中，连续的氮输入增加了与氮循环相关的一些土壤细菌的新陈代谢活性，例如净氮矿化速率和净硝化速率。有趣的是，Cytophagia，Bacilli，Gemmatimonadetes和Acidobacteria受土壤化学和微生物属性的负向影响。实际上，Cytophagia的相对丰度与土壤基础盐离子紧密相关，通常指土壤盐分水平，土壤盐分含量与大多数土壤属性是负相关的（表4）。Bacilli的大多数物种拥有忍受高盐分的能力，并且能经受恶劣的环境（Sharma et al., 2015）。而且，之前的研究表明在盐分影响的土壤中洪水促进Actinobaceteria和Gemmatimonadetes，并且Gemmatimonadetes的相对丰度与土壤酶活性相反并且随着栽种年数显著降低。这可能归因于这些细菌的耐盐和寡营养特性（Gad, 2014; de León-Lorenzana et al., 2017）。
结论
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