科研 | Fungal Ecology：土壤真菌群落对长期火烧停止和施氮的响应 / 四六文摘

编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

在草地中，火烧管理和施氮是植物群落改变的驱动因素，但是相关的土壤真菌的响应还不明确。本研究预测土壤真菌群落将会发生季节性改变，几十年火烧的停止和施氮可能会改变真菌的分布，并且植物和真菌群落的改变可能相关联。在一年中（对来自于一个30年的火烧和施氮实验）每月进行了表层土壤的取样评估真菌群落动态以及与植物群落异质性之间的联系。ITS基因群落组成具有季节稳定性，除了在火烧和施氮处理中夏季增加的丛枝菌根真菌的丰度外。长期处理影响土壤真菌和植物群落，并且与异质性格局相关联。尽管在火烧停止处理中木本植物侵占，但是其土壤真菌群落与森林中的不同。本研究提供证据支持真菌与植物群落对长期草地火烧和施氮的反馈强度。

论文ID

原名：Soil fungal community changes in response to long-term fire cessation and N fertilization in tallgrass prairie

译名：在高草草地土壤真菌群落对长期火烧停止和施氮的响应

期刊：Fungal Ecology

IF：3.990

时间：2019.5

通讯作者：Lydia H. Zeglin

通讯作者单位：堪萨斯州立大学

实验设计

研究地点（39°05´N，96°35´E）位于Konza草地生物研究站（KPBS），存在一个长期火烧和施氮的野外实验，实验采用裂区的实验设计。本研究从1986年以来在每年施氮（10 g N m^-2yr^-1，NH₄NO₃）或未施氮、每年火烧或未火烧的12.5 m×12.5 m重复样地中取样，研究不同管理水平的高草草原土壤真菌群落动态。在KPBS优势植被是C4植物，例如Androppogon gerardii, Sorghastrumnutans, Panicum virgatum 和Schizachyrium scoparium，尽管在未火烧处理中火烧的抑制促进了灌木植物的优势，例如Juniperus virginiana, Cornus drummondii和Rubus occidentalis。本研究地点夏天干燥炎热，冬天寒冷湿润，年平均降雨量为835毫米，年平均温度为12.9℃。长期火烧和施氮处理没有影响土壤有机质含量和土壤pH。

从2014年11月到2015年12月（除了2014年12月和2015年2月）在所有处理的重复样方中进行表层（15厘米）核心土壤的采集。四个处理[火烧不施氮对照（BC），火烧和施氮（BN），未火烧和未施氮（UBC），未火烧和施氮（UBN）]包含在4个重复的区组中。所有样方的土壤在2015年4月年度火烧处理一周后收集，在2015年6月年度施氮一周后收集。采用无菌技术从每个样方中的三个随机位置采集直径为2cm的核心土壤，均匀混合成一份样品，放置在冰上，立即带回实验室，并在-20℃冷冻，直到进一步分析。

对采取的土壤进行DNA的提取，定量PCR以及高通量的测序。每个样品的所有数据抽平到7466个序列，在97%的序列相似水平上进行物种注释。使用UNITE数据库进行物种注释。最终的数据集包含4049个独特的OTUs。使用UNITE-compatible FUNGuild数据库将OTUs分配到不同的功能群。基于养分吸收策略，将OTUs划分为与生态有关的功能群，例如病原菌，腐生真菌或者共生体（Nguyen et al., 2016）。因为在草地生态系统中丛枝菌根真菌对植物营养尤为重要并且外生菌根与许多灌木植物物种有联系，所以在本研究中粗略的将共生体分为丛枝菌根（AM），外生菌根（EcM）和共生的OTUs（不属于前两类的其他共生体）。对于4049个OTUs只有1290个（32%）根据FUNGuild进行了功能类群的划分。

在2015年7月下旬进行了植物群落组成的评估和每个物种盖度的评估。此外在生长季顶峰（9月份）收集了每个样方植物生物量，包括当年新产生的生物量（地上净初级生产力）和几年前产生的死的生物量。

在数据分析之前，所有的变量使用Shapiro-Wilk’s 检验数据正态性，如果必要，会对数据进行log转化来满足正态性（ITS分类单元相对丰度和植物生产力）。在R studio中使用“lme”包进行重复测量的方差分析（两因素），样方作为随机变量，采用混合效应模型，由于裂区的样方设计然后进行分层，评估所有各变量的火烧，施氮和取样日期的个体效应和交换效应。类似地，使用混合效应模型和类似的R包评估火烧和施氮对所有植物变量的影响。使用“vegdist”函数创建一个Bray-Curtis非相似性矩阵，使用“metaMDS”函数创建一个非度量多维标度排序，产生一个最优的双轴。对于植物和真菌群落，“adonis”函数基于Bray-Curtis非相似性矩阵和置换方差分析检验处理效应（vegan包）。通过测量和比较排序云的大小来评估子样方的异质性（“betadisper”方程，“vegan”包）。使用Mantel tests（“mantel”方程，“vegan”包）评估了7月份的植物，土壤真菌和细菌群落的距离的相关关系；也使用Mantel test评估了植物，真菌和细菌群落与土壤环境变量（pH，SOM和GWC的Bray-Curtis非相似性）。在R Studio中使用“cor.test”函数，使用Pearson’s R 系数和相关联的p值评估了NMDS轴和可能的协变量pH，SOM，GWC，ANPP，禾草%，灌木%以及杂类草%之间的相关性。使用R Commander，配对t-检验用来评估处理间真菌分类群相对丰度的变化。

结果

真菌群落组成受30年火烧和施氮处理的显著影响，但是不随月份改变（表1，表2，图1A和图2A和B）。共变异分类群的相对丰度在施氮和火烧历史中都沿着NMDS轴一和轴二变化，表明在未火烧和火烧处理中土壤中存在不同的分类群。根据置换方差分析的结果，火烧历史，施氮以及它们的交互作用分别解释了OTU非相似性矩阵总的变异的5.1%，4.7%和1.7%（表2）。真菌丰富度的范围在146到524，在不同的取样月份和火烧历史中显著不同。综合考虑所有的处理时，真菌丰富度在三月份最低，在四月份有所增加，在一年中剩下的月份中较高。在每年火烧的土壤中，真菌丰富度在整年当中都较低（表1，图2C）。香浓多样性在三月份最低，但是在长期处理中没有变化，并且真菌均匀度在月份和历史处理中没有改变（表1）。在群落组成中没有随着火烧和施氮事件的时间响应，但是在丰富度中存在时间的变化。

图1基于Bray-Curtis距离矩阵的NMDS分析，土壤真菌群落（A），土壤细菌+真菌群落（B），以及2015年7月份测定的植物群落（C）。BC=火烧对照，BN=火烧施氮，UBC=未火烧对照，UBN=未火烧施氮。

图2 在2014年11月到2015年12月期间所有处理土壤样品中的真菌ITS的NMDS轴一（A）和轴二（B），以及真菌丰富度（C）。

在这个数据集中Ascomycota占优势（76.1%），其次是Basidiomycota（21.5%），然后是Zygomycota和Glomeromycota。OTUs的总数目是4049，AM占0.2%，EcM占2.3%，病原菌占6.1%，腐生菌占19.5%，其他共生体占3.9%，未识别的分类群占68%（图3）。对于划分的分类群，腐生菌，病原菌以及其他的共生体主要属于Ascomycota（每个分类群中分别是70.7%，55.8%和71.4%），EcM属于Basidiomycota（58.8%），AM全部属于Glomeromycota。在Glomeromycota门中，检测到的所有的读数中51.2%属于Glomerales目，42.7%属于Archaeosporales目。

图3 土壤优势真菌类群和功能群平均相对丰度。

少数真菌类群对长期施氮或者火烧有显著的响应：Glomeromycota/AM的比以及腐生菌在氮肥添加的土壤中更丰富，指定的病原菌在氮肥添加和未火烧的土壤中更丰富，并且没有显著的交互作用。Basidiomycota呈现火烧，月份，施氮三方面的交互作用，可能折射出这个类群在火烧，不施氮，以及11月份的时候拥有相对较高的丰度（图4B），尽管多重比较是不显著的。Ascomycota在未火烧的土壤中有相对较高的趋势（图3和4A），尽管不显著。在所有的处理中，Glomeromycota/AM真菌的比以及Zygomycota的相对丰度在经历3月份的低点后增加（图4C和D）。在7与8月，Glomeromycota/AM比的相对丰度在火烧和施氮的土壤中比其他样方和月份中的要高4倍以上（图4C）。进一步分析表明，以上的增加主要受Archaeosporales目的驱动（图4E），而不是Glomales目（图4F）。

图4 在2014年11月到2015年12月期间，土壤真菌类群（门或者目）在每个处理中的相对丰度。

长期处理也显著影响植物群落组成（图1C，表1），火烧历史，施氮以及它们的交互作用分别能解释24.8%，15.6和10.5%的植物群落的变异（表2）。木本植物，草本以及地上净初级生产力的相对丰度与植物群落方向轴显著关联，然而非禾草植物丰度，SOM，GWC和pH不相关（图1C）：这折射出随着长期火烧的停止，植物盖度从草本向木本的显著转变以及长期氮添加使地上净初级生产力增加116-198%。每5平方米植物物种的丰富度为4到21个，均匀度的范围在0.03到0.44，香浓多样性在0.15到1.97。植物丰富度在未施氮的样方中更高，植物均匀度和多样性在每年火烧和施氮样方中最低（表1）。所有火烧和施氮样方中P. virgatum为优势种，相反地，在火烧和未施氮的样方中，占优势的植物群落是A. gerardii, P. vigatum 和S. scoparium。在未火烧和施氮的样方中植物群落组成的异质性最高（图1C），在四个子样方中要么P. virgatum, Sporobolus compositus,Symphoricarpos orbiculatus 和C. drummondii占优势要么R. occidentalis占优势。

因为在土壤真菌群落中没有观测到显著的月份周转，7月份的土壤真菌OTU相对丰度距离矩阵的数据集用来评估与植物群落组成的相关性（图1A,C）。这些群落距离矩阵也与7月份的16S rRNA基因群落距离和土壤环境距离相比较，来评估植物群落组成与真菌组成的关联性强于细菌组成与环境。Mantel test的结果表明真菌ITS和植物群落距离显著相关，然而16S rRNA基因群落距离与植物群距离不相关（表4）。此外，真菌ITS和植物群落距离与土壤环境差异显著相关，但是16S rRNA基因群落距离与其不相关（表4）。

讨论

30年的草地管理显著改变了土壤真菌群落组成，表明氮添加和火烧对土壤真菌有抑制（图1，表2）。尽管，本研究期望由于夏天和冬天植物输入会导致资源和有效性的差异，或者对施氮和火烧事件直接的短期响应会导致土壤真菌群落随着月份会不同，然而，真菌群落或者功能类群都没有随着月份而改变（图2）。因此，观测到了重复样品之间巨大的空间异质性，而不是时间异质性。评估植物，真菌和细菌群落距离的相关性表明植物和土壤真菌群落的异质性相关联，不像植物和土壤细菌群落。然而，土壤真菌群落不像植物群落那样对长期施氮和火烧停止有显著的响应，无论是在丰度，异质性还是组成上，表明其他因子（例如土壤环境）在调节土壤真菌分类群和功能改变上也扮演着重要的角色。

1 对火烧和施氮事件的短期响应

与长期火烧和施氮的影响相反，没有证据表明短期内土壤真菌群落对春季火烧或者施氮有响应。总的真菌ITS基因丰度也没有对施氮或者火烧有响应（Carson and Zeglin,2018）。在森林生态系统的真菌群落对火烧有响应，燃料更多并且热量能渗入土壤深层。在草地生态系统，相对于森林观测到的温度土壤温度仅仅只达到了一部分，并且仅仅只存在一点点热量进入土壤深层，所以火烧的大部分影响是由于地上凋落物蒸腾导致养分改变，土壤干燥，太阳辐射增加的间接影响，而不是火烧期间的直接致死。在施氮的土壤中分类群可能在一整年中持续繁荣，或者相对于未施氮的土壤氮的有效性在整年都有所增加。在火烧事件后真菌的丰富度以及Glomeromycota和Zygomycota的丰富度都有所增加，但是这种响应发生在所有的处理中，因此不能归因于火烧。

本研究也期望土壤真菌群落能够折射出植物物候的季节变换，例如在整个夏天更多的光合产物输入到地下可能会增加与植物相关的真菌和病原菌的相对优势度，然而依赖于凋落物的腐生真菌可能在冬天更占优势。然而，本研究所针对的真菌功能群中只有Glomeromycota和AM展现出一些季节性的变化，在整年中，Glomeromycota和Zygomycota的相对丰度增加，真菌OTU丰富度增加，没有展现出季节性的规律。在1月和9月真菌ITS基因的总丰度在这些土壤中没有显著的变化，在10月时下降，到12月又增加到起初的水平（Carson and Zeglin, 2018）。在生长季末随着植物分泌碳输入的丢失，真菌群落有可能会发生更替，然而没有检测到群落的转变。在生长季最小的时间动态可能暗示着在整年存在着与植物相关的专性真菌或者病原菌的休眠体。一些假定的病原菌可能不是专性病原菌，所以在冬天也可能选择腐生状态或者依赖于其他寄主获取营养。反过来，腐生真菌种群在冬季和夏季都可能持续存在，依赖于大量细根凋落物和土壤有机质中相对恒定的有效基质（Schmidt et al., 2007）。除了营养获取策略外，真菌可能由于它们的产生时间更长，更大的生长形式和提供了一些保护免受环境压力坚硬的细胞壁而对季节变化不太敏感（Schmidt et al., 2007）。与土壤真菌弱的季节动态相反的是，在6、7和8月，在本研究的土壤中细菌丰度增加了一个数量级，然后又减少了，表明在夏天细菌对植物光合作用产物和分泌物响应很强烈。尽管真菌的季节动态和对短期干扰的响应很小，但是长期的氮添加会的导致不同的真菌群落（图1-3）。

2 对长期施氮的长期响应

氮添加会影响土壤环境和植物-真菌反馈的很多方面，但是在草地土壤中其中一个建立完好的机制是通过养分化学计量的改变来调节。在土壤生物有效磷含量相对较低的Flint Hills生态区，由于植物对磷的需求增加和对AM的磷获取依赖，增加土壤氮有利于促进AM的定殖和菌丝的觅食活动。本研究的数据支持这一磷-限制植物-真菌-土壤反馈机制，因为在施氮的土壤中Glomeromycota/AM比在一整年的相对丰度都较高（图4C）。显而易见的，在2015年7月份，AM中的Archaeosporales目在未施氮的土壤样品中没有检测到，但是在火烧和施氮土壤中它们的相对丰度是未火烧和施氮土壤中的8倍，AM中的Glomales目与其没有类似的格局（图4E和F）。在这些火烧和施氮样方中植物群落也与其他长期处理不同：接近于P. virgatum（暖季草）的单种栽培（95%的盖度），相对于未施氮多样性高的样方地上净初级生产力增加了3倍（表3）。在高草草地，AM通常与暖季禾草相关联，但是有研究表明相对于其它的暖季禾草，P. virgatum有相对低的菌根依赖。在本研究中，选取的是非根际土壤，因为本研究不能确定物种专一性的植物-AM共生关系，所以需要额外的研究评估假定的Archaeosporales-P. vigratum的相关性。一般来说，AM与寄主植物之间的关系可以通过给予寄主竞争性的养分获取和生长优势，在多年的时间尺度上产生正反馈。

相反地，增加的土壤氮的有效性可能通过增加真菌病原菌改变植物-真菌负反馈，病原菌会在养分有效性更高和更稳定时变得更普遍和专一。这一现象在农业生态系统中是主要的问题，在那里植物物种专一性病原菌会减少作物产量；然而在天然的草地中，真菌病原菌能够支持更多的植物物种多样性，其在多个营养级水平上具有理想的反馈。然而，在本研究中，在氮肥添加的土壤中，假定的真菌病原菌更丰富，并且伴随着较低的植物物种多样性和较高的地上净初级生产力，这与本研究期待的格局相反。这些病原菌可能由堆积的凋落物中的繁殖体组成，与共存的植物物种没有直接的相互作用，或者指定的病原生命史数据库不适用于我们研究地点的植物宿主。未来的研究工作有必要去了解这些真菌群落的改变是否与植物动态相关联，或者平行，但是独立于对长期氮添加的响应。

3 对火烧停止长期响应

30年的火烧抑制对土壤真菌分类群和功能分布有显著的影响（图1-3，表2）。这种改变主要与Ascomycota分类群和病原菌功能类群相对丰度的增加相关联（图3和4A）；然而这个数据集中大多数分类群是没有指定功能的Ascomycota，使解释这种转变变得具有挑战性。在火烧停止后植物群落向木本植物转变的广泛背景下（图1C），值得注意的是地下真菌群落没有呈现“类似森林”（Basidiomycete和EcM占优势）的组合。实际上，在火烧，未施氮的高草草地非根际土壤中Basidiomycete的相对丰度呈现最高趋势，与灌木植物盖度相关联（表1）。在本研究中所有的杂类草和木本植物与AM相关联，但是与EcM和共生体不相关，除了非菌根Alliaria petiolata和Amaranthus rudis。如果木本物种与AM形成共生关系，那么木本植物物种在高草草地火烧抑制的情况下可能具有非EcM专性寄主植物的特征（Williams et al., 2013）。灌木的入侵对草原和牧场的保护以及可持续的管理构成了广泛的威胁，之前的工作表明简单的向为火烧的草地引入火烧不能补救长期的灌木入侵。虽然从本研究的数据不能完全理解灌木入侵和真菌共生体繁荣之间的联系，但是对这些联系很好的理解有助于管理和防止灌木入侵原生的草地。

腐生菌的相对丰度在每年火烧和未火烧处理中没有差异，但是在长期施氮处理的土壤中较高（图3）。这点是令人惊讶的，因为定期的火烧会清除地上植物物质，减少腐生菌地表有效凋落物的量（Blair, 1997）。然而，该高草草地之前的研究结果表明火烧历史不会影响分解速率，不管是更高的总的土壤碳，还是更低的碳氮比（Reed et al., 2009）。在本研究中，长期施氮使净初级生产力提高了2-3倍，所以在生长季末到晚春火烧期间会返还更多的新鲜凋落物。在凋落物凋落的头几个月，来源于凋落物的有机质大量渗入到土壤中，这可能足以支持更多的土壤腐生真菌。腐生真菌对施氮的积极响应可能也反应了腐生真菌在分解复杂凋落物资源方面投入较少。总而言之，火烧停止后真菌群落的转变不能反应凋落物的质量和菌根状态。由于植物物种的周转，有效的有机底物组成的改变，应当在草地土壤作为主要的真菌群落改变的驱动因子被调查。

3 植物和土壤微生物群落改变之间的联系

30年的火烧停止和施氮，土壤真菌群落显著改变，但是程度比植物群落小（表1，表1，图1）。在每年火烧的样方中，施氮引起了A.gerarddi/S.scoparium/P.vigatum共占优势的群落向P.virgatum近乎单独占优势的群落转变（图1C）。这可能归因于A.gerarddi在土壤氮较低的时候占优势，然而P.vigatum通常在氮不受限制的条件下表现出竞争优势。与之形成对比的是，在施氮和未火烧的样方中，每个样方的优势植物都不同，这可能暗示着优先效应的存在。本研究的相关植物和真菌群落数据仅代表在小区尺度上的协变量估计，因为采集样本并不是为了能够识别与单个植物直接相关的真菌分类群：每个样方的多个土壤核心被混合成一份样品以测量真菌组成，在两个5平方米的植物组成子样方之外收集这些核心土，以尽量减少植物干扰。此外，大量土壤真菌群落中的许多OTU不是直接共生体或病原体（图3），也不一定与栖息在不同植物物种的根组织中的真菌相似。优势植物物种为土壤真菌提供了碳，因此优势植物周转在样方尺度上能影响真菌群落组成。然而，由于很多原因在样方尺度上真菌周转的强度弱于植物群落周转。根和茎的数量和质量对真菌群落的影响可能不是植物物种特有的，在本研究中腐生的类群可能比个体的植物周转响应更大，或者其它重要的驱动因子可能影响真菌的群落聚集。

本研究的数据也展现了植物和土壤真菌群落距离在所有实验的样方中是相关的，然而植物和土壤细菌群落距离是不相关的（表4）。尽管土壤真菌群落对长期变化的响应弱于植物，但是真菌周转与植物组成的变化的联系强于与土壤细菌周转。一般而言，自由生活的土壤真菌为了生存从复杂的凋落物资源中获取养分,拥有几个胜于土壤细菌竞争优势，这表明真菌更有可能是植物凋落物最主要的分解者，并且可能是特定凋落物类型的专一分解者。反过来，有证据表明细菌群落可能依赖于真菌或者真菌分泌物作为养分来源。土壤中的细菌相对于真菌也更有可能由微尺度生境因子构成，包括土壤空隙大小分布，水分利用效率和土壤矿物，或者以非物种特有的方式对不稳定的C输入作出响应。植物、真菌和细菌在异质土壤生境中的直接和二次相互作用以及中性共存网络是复杂的。本研究的实验数据表明长期火烧和施氮对植物和真菌群落的影响可能部分通过植物-真菌反馈构建，然而土壤细菌群落的响应独立于植物群落的周转。

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