科研 | Science：CX3CR1+单核吞噬细胞控制机体对肠道真菌的免疫反应

本文由卡内斯坦编译，董小橙、江舜尧编辑。

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导读

肠道真菌是肠道菌群的重要组成部分。但是宿主针对肠道真菌的免疫反应的具体机制目前尚不清楚。通过小鼠实验、细胞实验和人体实验，作者揭示了CX3CR1⁺单核细胞（MNPs）介导机体针对真菌的免疫反应的具体机制。

论文ID

原名：CX3CR1⁺mononuclear phagocytes control immunity to intestinal fungi

译名：CX3CR1⁺单核吞噬细胞控制机体对肠道真菌的免疫反应

期刊：Science

IF：41.058

发表时间：2018年

通信作者：Iliyan D. Iliev

通信作者单位：Gastroenterology and Hepatology Division, Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medicine, New York, NY 10021, USA

实验设计

通过小鼠实验和细胞实验，作者首先明确了肠道的CX3CR1⁺MNPs 能够识别和吞噬肠道真菌；然后，对CX3CR1⁺MNPs诱导适应性免疫反应的机制和对肠道菌群结构的影响进行研究；最后，发现CX3CR1基因多态性与人体抗真菌缺陷有关。从而系统性地揭示了，CX3CR1⁺MNPs对机体针对肠道真的免疫反应具有控制作用。

实验结果

实验1：CX3CR1+ MNPs 能够识别和吞噬肠道真菌

将人类的机会性肠道共生真（菌白色念珠菌）定殖到小鼠肠道后，分析不同肠道吞噬细胞表面共刺激分子表达水平发现，只有CX3CR1⁺MNPs上CD40和CD86表达水平被改变。从肠道固有层中纯化CX3CR1⁺MNPs细胞后，用RNA测序对CX3CR1⁺MNPs和CD11b⁺CD103⁺DCs（已证明其参与肠道真菌感染的免疫反应）的表达谱进行比较。虽然这两种细胞都表达抗原呈递基因，但CX3CR1⁺MNPs的真菌识别相关基因表达水平更高。定量PCR和流式细胞分析证实，编码真菌C型凝集素受体（CLRs）Clec7a、Clec6a和Clec4a的转录子在CX3CR1⁺MNPs显著高表达。显微共聚焦分析显示，肠道吞噬细胞能够快速识别并吞噬白色念珠菌，且超过80%的CX3CR1⁺MNPs都吞噬白色念珠菌。

综上，活体实验表明，驻肠道的CX3CR1⁺MNPs能够快速识别和应对肠道真菌。

图1 CX3CR1 MNPs 表达抗真菌受体并识别肠道真菌

实验2：CX3CR1⁺MNPs通过Syk 通路诱导获得性免疫

通过杂交获得两种缺陷型小鼠：（1）CX3CR1⁺MNPs正常，CD11b⁺CD103⁺DCs缺失，称为ΔIrf4小鼠；（2）CD11b⁺CD103⁺DCs正常，CX3CR1⁺MNPs缺失，称为ΔCX3CR1 小鼠。对于正常小鼠，白色念珠菌定殖会在回肠和肠系膜淋巴结（mLNs）引起较强的T_H17反应。对于ΔIrf4 小鼠，CD11b⁺CD103⁺DCs缺失并不影响T_H17细胞的数量；而ΔCX3CR1 小鼠中，CX3CR1⁺MNPs缺失导致回肠和mLNs T_H17细胞显著减少。

在机体稳态条件下，CX3CR1⁺MNPs缺失降低了针对针对共生热带念珠菌的IgG抗体水平，但对针对共生细菌鞭毛抗原的IgG抗体水平无影响。比较肠道白色念珠菌定殖和系统性白色念珠菌感染发现，野生型同窝小鼠在两种情况下都能够系统性地产生针对白色念珠菌的IgG 抗体；而ΔCX3CR1 小鼠对系统性感染能够产生无差异的抗体水平，而对肠道白色念珠菌产生的抗体水平显著降低。即CX3CR1⁺MNPs缺失只影响肠道局部抗真菌抗体产生。CD11b⁺CD103⁺DCs缺失或CD11b-CD103+DCs缺失对两种情况下系统性抗体产生都无影响。与野生型小鼠相比，白色念珠菌感染对ΔCX3CR1 小鼠的伤害更严重；而对 ΔIrf4 小鼠和Batf3^-/-（CD11b^-CD103⁺DCs缺失）小鼠的影响与野生型小鼠无显著差异。

喂食表达主要组织相容性复合物II 型限制的OT-II 肽段的白色念珠菌后，移植荧光标记的针对OT-II 特异的CD4⁺T细胞。与对照小鼠相比，CX3CR1⁺MNPs缺失导致在回肠和mLNs 中T_H17细胞的抗原特异增殖显著降低。根据文献报道，CX3CR1⁺MNPs可能直接将真菌抗原转运至mLNs 以激活T 细胞，也有可能将抗原传递给其他迁移型吞噬细胞。因此，CX3CR1⁺MNPs在诱导T_H17细胞和抗体反应中都有重要作用。

脾酪氨酸激酶（Syk） 对于启动多个CLRs 的下游级联反应都很重要，且在CX3CR1⁺MNPs中高表达。特异性的CX3CR1⁺细胞Syk 缺失的小鼠，肠道真菌过度生长；对肠道念珠菌定殖，T_H17应答和抗真菌抗体表达不足。因此，CX3CR1⁺MNPs中CLR通路完整对控制真菌定殖、有效诱导针对肠道真菌的适应性免疫反应很重要。

图2 CX3CR1+ MNPs控制肠道的抗真菌免疫反应

实验3：CX3CR1⁺MNPs影响真菌菌群结构及肠道炎症

对小鼠肠道菌群，用内部间隔区1和16S 深度测序鉴定真菌菌群结构，用细菌核糖体DNA 测序鉴定细菌菌群结构。结果发现，CX3CR1⁺MNPs缺失对肠道细菌菌群的β多样性和α多样性没有显著影响。但和对照小鼠比，CX3CR1⁺MNPs缺失提高了真菌的α多样性（子囊菌门的丰度和多样性提高导致），即改变了小鼠的肠道真菌菌群结构。因此可认为，CX3CR1⁺MNPs对免疫监视和维持肠道真菌菌群平衡有重要作用。

与对照小鼠相比，ΔCX3CR1 小鼠对DSS 诱导的结肠炎更敏感。小鼠摄入对念珠菌和其他双相型真菌（子囊菌门）有杀灭作用的氟康挫（Fluconazole），能够改善ΔCX3CR1 小鼠的肠道炎症。将 ΔCX3CR1 小鼠的粪便移植到无菌小鼠中，对无菌小鼠的结肠炎无显著影响。因此，ΔCX3CR1小鼠的肠道菌群无致病性。但ΔCX3CR1 小鼠摄入热带念珠菌或者白色念珠菌，会导致严重的消耗性疾病（如结肠萎缩）和肠道真菌过度增殖（但仍然无法引起系统性的抗真菌IgG 应答）。而对照小鼠不会发生。因此，CX3CR1⁺MNPs对控制肠道疾病状态下的真菌菌群非常重要。

图3 CX3CR1+ MNPs缺失改变肠道菌群结构、加重肠道疾病

实验4：人体CX3CR1基因突变与疾病相关

CX3CR1⁺MNPs具有吞噬小鼠和人的共生真菌的能力。之前的研究报道也显示，CX3CR1基因多态性与人类炎症疾病（如动脉硬化和冠心病）有关。但分析发现，这些多态性都与炎症性肠道疾病（IBD）无关。但503个Crohn 病例队列研究表明，CX3CR1 T280M 多态性与针对酿酒酵母甘露聚糖抗体（ASCA）IgG阳性相关。IBD 病例中针对细菌抗原和宿主抗原的抗体水平并不受此突变的影响。与野生型相比，CX3CR1 T280M纯合子病人无法正常地系统性产生针对子囊菌门多种共生真菌的IgG抗体，但可正常产生针对细菌鞭毛抗原的抗体。因此认为，CX3CR1突变导致人体针对肠道真菌的免疫应答存在缺陷。

图4 CX3CR1基因编码区位点多态性与Crohn 病人抗真菌IgG 水平降低有关

综述结论

通过研究，作者找到了能够识别和对肠道真菌应答的驻肠道吞噬细胞亚群——CX3CR1⁺MNPs。它通过Syk 依赖的通路引发机体针对肠道真菌的适应性免疫，并影响结肠炎状态下的肠道菌群结构。最后，作者在人体中找到了一个证明CX3CR1参与机体抗真菌免疫的基因突变，CX3CR1 T280M。综上，本研究证实CX3CR1⁺MNPs能够识别肠道真菌并引发相应的天然免疫和适应性免疫反应，为肠道真菌菌群影响局部和全局免疫反应提供了证据。

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