编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。
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导读
神经性肠病毒（EV）（如脊髓灰质炎病毒）一直以来都被认为与麻痹性疾病有关。虽然经过努力，全世界的脊髓灰质炎患者明显减少，但类似麻痹综合征的另一种疾病——急性迟缓性脊髓炎（AFM）仍引起人们的担忧，因为它可能与另一种神经性肠病毒有关。目前AFM的患病原因仍不清晰，而且在患者的脑脊液中可能因为肠病毒RNA量很少或PCR引物等因素，使其很难被检测到。为了解决这一问题，本研究采用病毒捕获高通量测序（VirCapSeq-VERT）技术及肽微阵列分析的方法对从AFM患者及非AFM三个对照组患者中采集的样品进行分析鉴定，发现除了已报道过的肠病毒VP1衣壳蛋白12个氨基酸的保守肽区域，还新发现了一个存在于肠病毒EV-D68 VP1衣壳蛋白羧基端含22个氨基酸的线性保守肽区域。这个线性保守肽区域只对AFM组的样品具有免疫反应活性，对照组没有任何免疫活性。本研究进一步证明了肠病毒感染可能是急性迟缓性脊髓炎的一个发生原因，同时也为AFM疾病的诊断和治疗提供了新的线索和途径。原名：Antibodies to Enteroviruses in Cerebrospinal Fluid of Patients with Acute Flaccid Myelitis
译名：肠病毒抗体在急性迟缓性脊髓炎病人的脑脊液中
期刊：mBio
IF：6.747
发表时间：2019年8月13日
通讯作者：W. Ian Lipkin
通讯作者单位： 美国纽约哥伦比亚大学梅尔曼公共卫生学院感染与免疫中心
DOI：https://doi.org/10.1128/mBio.01903-19
本文的实验组及对照组样本数据均是从美国疾病控制与预防中心（CDC）收集的，这些实验组急性迟缓性脊髓炎（AFM）样本都已被CDC利用实时荧光定量反转录PCR技术（rRT-PCR）及Sanger测序法等分析过肠病毒及其种类。首先，作者采用VirCapSeq-VERT技术和肽微阵列的方法对样品进行研究。研究的对象主要是从2018年发病的14位AFM患者中（包括13名儿童和1名成年人）采集的成对脑脊液样品和血清样品、呼吸道样品及粪便样品，也包括设置的三个对照组，分别是（i）与AFM患者同一时间段收集的5位非AFM中枢神经系统疾病的儿童患者（NAC）及2019年收集的另一位NAC儿童患者；（ii）10名患有川崎症的儿童（KDC）；（iii）11名患有非AFM中枢神经系统的成年患者（AC）。同时以2010年刚果采集的Ⅰ型脊髓灰质炎样品和脊髓炎脑脊液标本样品为检测的阳性对照。然后，研究者对于VirCapSeq-VERT技术产生的所有核苷酸进行分析，去除人类基因组和核糖体的序列后，分别使用MegaBlast和BLAST针对非冗余核苷酸和蛋白质数据库分析剩余的病毒序列。为了评估VirCapSeq-VERT技术在检测肠病毒RNA时的效率，作者通过qRT-PCR对脑脊液样品中的肠病毒RNA进行了定量分析。最后，作者用样品制成的血清芯片进行肽微阵列分析，并对高密度肽微阵列对实验组和对照组的免疫反应活性进行了分析和评估。
样本的病毒学检测和VirCapSeq-VERT测序分析实验组AFM和对照组NAC样本中的脑脊液（CSF）样品、粪便样品和呼吸道样品均进行了病毒学检测。其中，作者在AFM组中的CSF样品和7%粪便样品中检测到EV-A71， 而对照组NAC中有一个样本在CSF、粪便和呼吸道样品中均检测到艾柯病毒25（E-25），在AFM组50%呼吸道样品和NAC组33%粪便样品中检测到了肠病毒。研究者通过VirCapSeq-VERT测序产生了大约320,000,000个单端reads。经过主机减法去除了88.7% reads，剩余大约36,000,000个 reads进行下一步的分析。经过重新组装产生了大约271,000个拼接序列（contigs）和9,700,000个单一序列的reads（singletons）。通过NCBI网站上的核苷酸BLAST分析确定其中的10,623个contigs和4,900,000个singletons属于细菌类。同时通过对含有Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的对照组CSF样品进行检测，产生了65个reads，其中29个属于脊髓灰质炎病毒，基因组覆盖率达60.7%。在已经通过PCR和Sanger测序法分别在AFM-07和non-AFM-16样品中鉴定出EV-A71和E-25的情况下，作者接着使用VirCapSeq-VERT测序再次对这两个样品进行检测，结果并没有在脑脊液样品中检测到除肠病毒以外其他病毒的reads。对于AFM-07和non-AFM-16这两个样品，本研究使用VirCapSeq-VERT测序法分别测出了16,994个，58,206个肠病毒reads，与肠病毒的基因组比对发现，基因覆盖率达99.0%和74.8%。作者通过空位-填充PCR和5’端、3’端不翻译区域扩大的方法实现病毒性基因组的完全复原。本研究对AFM-07和non-AFM-016两个样本的脑脊液样品进行实时荧光定量PCR，分别得到大约每微升11,000和270个拷贝的肠病毒RNA。急性迟缓性脊髓炎-血清芯片（AFM-SeroChip-1）的制备和高密度肽微阵列分析本研究使用基于Roche Nimblegen平台的可编程肽微阵列通过研究脑脊液和血清中的抗体来寻找中枢神经系统被感染的间接证据。AFM- SeroChip-1这个芯片的设计包含160,000条独特的12个氨基酸肽，其中11个为重叠的氨基酸肽，这囊括了所有人类肠病毒（肠病毒种类EV-A，EV-B，EV-C，EV-D）的跨衣壳蛋白（VP1，VP2，VP3和VP4）及所有西尼罗河病毒（WNVs）的所有聚合蛋白，使用的这些序列是在2019年1月31日从NCBI网站上下载得到的。同时AFM- SeroChip-1也包括1,000个随机12个氨基酸肽，从而检测样品中的非特异性结合。本研究使用AFM- SeroChip-1芯片对实验组AFM中的14个脑脊液样品和三个对照组（NAC，KDC和AC）中的27个脑脊液样品就肠病毒（EV）和西尼罗河病毒（WNVs）这两种病毒进行IgM和IgG抗体检测。不过血清样品只能检测其中的一部分。作者通过肽微阵列对AFM组14个患者和NAC组6个患者的脑脊液样品进行抗体检测时，发现了在美国出现过的8种蜱传播的病原体，包括嗜吞噬细胞无形体（人粒细胞无形体病）、微小巴贝虫（巴贝虫病）、伯氏疏螺旋体（莱姆病）、包柔氏螺旋体、查菲埃立克体（人单核细胞埃立克体病）、立氏立克次体（落基山斑疹热）、哈特兰病毒和玻瓦桑病毒。作者考虑到西尼罗河病毒和蜱传播病原体都是群体性病原，可能会牵涉其中，因此也对它们进行了抗体研究。肠病毒（EV-A，EV-B，EV-C和EV-D）VP1衣壳蛋白保守肽的免疫反应性检测本研究采用高密度肽微阵列技术检测肠病毒衣壳蛋白组的免疫反应性。作者在肠病毒（EV-A，EV-B，EV-C和EV-D）VP1衣壳蛋白中确定了一个18个氨基酸区域（这个氨基酸区域包含来自每一种肠病毒7个重叠的12氨基酸肽）（图1），它与来自急性迟缓性脊髓炎患者的血清样品和脑脊液样品（图2）发生免疫反应。这个区域在肠病毒物种中高度保守，通常用于推断广泛的肠病毒免疫反应性。它可以总结为一个模型PALXAXETG，而在EV-D中，这个模型中的PAL被PSL代替（图1）。针对这一保守肽区域，本研究对实验组和对照组的脑脊液样品进行免疫反应性检测，发现AFM组中有79%脑脊液样品呈阳性，而三个对照组NAC、KDC和AC中分别有79%、0%和11%呈现阳性（P=0.023,0.0001和0.0028）
图1. 从NCBI网站下载的EV-A, EV-B，EV-C和EV-D参考序列中有免疫反应活性的VP1蛋白保守肽的基酸序列
图2. 实验组AFM及三个对照组NAC，KDC和AC脑脊液样品的VP1保守肽序列的免疫反应活性检测研究发现对照组NAC中一个来自被E-25感染患有急性中枢神经系统感染患者的脑脊液样品也对这一个肠病毒保守肽区域产生了免疫反应。同时也在11名AC患者中的2个脑脊液样品中发现了肠病毒肽的抗体，其中，这2个脑脊液样品来自2位重症监护病人，他们患有不同的非急性迟缓性脊髓炎的中枢神经系统类疾病。这两个成人患者中的一个患有先天性癫痫，另一个患有多发性硬化症。对照组KDC组中的脑脊液样品中并没有发现任何肠病毒肽的免疫反应（图2）。而在AFM实验组或非AFM病人的脑脊液样品中，也没有发现西尼罗河病毒或蜱传播病原体的抗体。作者在所有的血清样品检测中发现，大约有90%样品对肠病毒的VP1保守肽序列产生了免疫反应（实验组AFM、对照组NAC，KDC和AC分别对应100%、100%、75%和100%）。急性迟缓性脊髓炎患者对应肠病毒EV-D68特异性VP1保守肽的免疫反应性尽管实验组AFM和对照组的血清样品中有70%的样品至少对一种肠病毒EV-D的VP1保守肽具有免疫反应性，作者仍在肠病毒EV-D68 VP1蛋白的羧基端鉴定出一个含有22个氨基酸的线性肽序列，这个序列只对实验组AFM患者的样品具有免疫反应性。在患有急性迟缓性脊髓炎的患者中，这个线性保守肽对43%的脑脊液样品和73%的血清样品具有免疫反应（图3）。相比之下，这个肽对于对照组的5个NAC患者、10个KDC患者或11个AC患者的脑脊液或血清样品均无免疫性。统计学分析表明，与三个对照组NAC、KDC和AC样品相比，实验组AFM的脑脊液样品（P=0.008，0.0003和0.035）和血清样品（P=0.135，0.002和0.009）均有差异。
图3.实验组AFM及三个对照组NAC，KDC和AC样品的EV-D68特异性22个氨基酸的VP1衣壳蛋白肽的免疫反应活性检测自2014年夏季起，美国确诊了超过560例急性迟缓性脊髓炎患者。大多数急性迟缓性脊髓炎病因的不确定性造成了重要的公共卫生干预措施的缺失，比如制定具体的诊断、治疗和预防措施。越来越多的研究证据表明，肠病毒包括EV-D68和EV-A71，可能与急性迟缓性脊髓炎有关。急性迟缓性脊髓炎与肠病毒EV-D68和EV-A71存在潜在联系的提出是基于以下三点：1.病毒RNA出现在患者的呼吸道和粪便样品中；2.研究发现，小鼠感染EV-D68会导致脊髓损伤、坏死和瘫痪；3.急性迟缓性脊髓炎的爆发与EV-D68引起呼吸道疾病的爆发具有时间相关性。然而，在AFM患者的脑脊液中却很少检测到肠病毒（美国疾病预防控制中心研究发现567例确诊的AFM患者中仅4例可以检测到肠病毒）。考虑到肠病毒与AFM的潜在联系，以及无法直接在脑脊液中检测其核苷酸这些因素，研究者通过检测脑脊液中肠病毒的特异性抗体来间接寻找患者感染肠病毒的证据。肠病毒感染在儿童中比较常见，但传统的免疫分析方法比如酶联免疫共沉淀（ELISA）由于交叉反应的原因，并不能有效的检测到肠病毒。病毒中和试验虽然被认为是检测的“金标准”，但是对于超过100种肠病毒这种大量的密集检测，进行病毒中和试验检测并不现实。因此，本研究采用的微阵列系统，可以高分辨率地同时筛选上千个所有已知的人类肠病毒多肽。整个肠病毒衣壳蛋白是由160,000个肽段拼接而成，其中，保守的肠病毒VP1衣壳蛋白肽段对79%患有AFM的儿童脑脊液样品具有免疫反应，然而这些样品大部分却检测不到肠病毒RNA。相比之下，对照组NAC患者的任何样品都检测不到肠病毒RNA，KDC患者在脑脊液样品中也没有检测到肠病毒肽的抗体。这个保守肽区域反映出广泛的肠病毒免疫反应活性，表明肠病毒感染与急性迟缓性脊髓炎有关。这个结果也与小鼠模型感染肠病毒的发病机制一致，包括EV-D68在内的肠病毒可以导致小鼠瘫痪。若通过比较脑脊液与血清中肠病毒肽含量的比值就证明肠病毒抗体是在脊髓鞘内产生的，这将为中枢神经系统感染提供更有力的证据。本研究并不能同时收集到足量的脑脊液和血清样品来分析排除肠病毒肽是从外周循环系统进入中枢神经系统这一可能性。然而，研究者认为这一可能并不能解释急性迟缓性脊髓炎患者脑脊液中肠病毒肽抗体的出现。在对照组16个病人（3个NAC，8个KDC和5个AC患者）的血清样品中检测到肠病毒肽抗体，其中只有2个成年患者和1个儿童患者的脑脊液中也检测到肠病毒肽抗体。在脑脊液中检测到肠病毒肽抗体的儿童存在着显著的中枢神经系统感染疾病，并且在其脑脊液样品中检测到了E-25。2个成年中的一个患有多发性硬化症，另一个先天性癫痫。此外，在印度戈勒克布尔的一项关于不明原因脑炎的研究中也使用了相同的肽段微阵列平台，他们检测发现77个儿童中仅有3个儿童的血清和脑脊液中同时存在肠病毒肽抗体。这3个儿童中的2个儿童根据症状和脑脊液中检测到肠病毒RNA（柯萨奇病毒或艾柯病毒）被诊断为肠病毒脑膜炎（来自N. Mishra 和 W. I. Lipkin的未发表数据）。本研究证明了肠病毒EV-D68特异性肽段（位于VP1衣壳蛋白的C末端）对实验组AFM患者脑脊液样品中49%都具有免疫反应活性，而对三个对照组NAC、KDC和AC患者的脑脊液样品中没有任何免疫活性。基于结构同源性分析，研究者预测肠病毒EV-D68菌株的VP1衣壳蛋白C末端会形成病毒中和免疫原和假定中和抗体的构象表位。因此，有73%AFM患者的血清对肠病毒EV-D68特异性肽段具有免疫活性，相比之下，对照组并没有免疫活性。作者的这些发现可能与美国AFM儿童与成年患者的血清阳性率研究不一致，他们使用病毒中和试验发现患者的血清几乎为100%的阳性率。这种差异的可能原因是，病毒中和试验可能会检测到其他非线性构象表位，而本研究的肽微阵列分析只能检测线性表位。作者认为检测一个肽段区域的活性无法与使用全病毒粒子进行病毒中和试验相比较。感染塞卡病毒的儿童血清检测的一个研究中，研究者发现NS2B蛋白抗体是特异性存在的，但有45%患者在刚确诊感染后6个月内检测不到的NS2B蛋白抗体。本文作者认为搞清楚EV-D68特异性肽对AFM患者具有高免疫活性，对照组却没有的原因，就可以阐明EV-D68的免疫反应原理了。作者的血清学研究发现支持了进一步探究急性迟缓性脊髓炎与肠病毒（包括EV-D68）之间的相关性。对于大多数急性迟缓性脊髓炎患者，病毒感染通常发生在其比较虚弱的前几天，这与患者呼吸道疾病出现的时间比较相符。本研究没有在AFM患者脑脊液中检测到EV-D68的RNA，这可能说明没有病毒从中枢神经系统的软组织进入到脊髓腔内。当然，也可能是脑脊液样品是在中枢神经系统清除病毒后采集到的。本研究的一个重要不足之处是相对于实验组数据收集的年龄、年份或季节，对照组的设置并不是最佳。尽管本研究者通过设置三对照组来检测本研究发现的特异性，但前瞻性的研究需要从相同的肠病毒爆发季节中设置合适的对照，这对检测研究的正确性十分重要。在AFM的其他病因还在研究时，本研究进一步证明了肠病毒感染可能是患AFM的一个原因。在不能直接检测病原体的情况下，中枢神经系统中存在病原体的抗体是患AFM潜在的一个重要指标。本文的研究结果值得进一步的研究，包括检测更多的样品、确诊分析和设计最优的对照实验。但是，本研究这些最初的研究结果为进一步探索肠病毒是如何引起AFM的，以及AFM的确诊和治疗提供了线索和途径。虽然麻痹性疾病（如小儿麻痹）现在已经得到比较好的控制，但这类疾病的发病机理并不是十分明确。现在仍有一些麻痹综合征类的疾病无法得到控制，如急性迟缓性脊髓炎（AFM）。本文通过采用VirCapSeq-VERT技术及肽微阵列分析的方法对实验组和对照组样品进行分析，进一步证明了肠病毒感染是患AFM的一个原因，同时发现了在肠病毒VP1衣壳蛋白羧基端的一个新的线性保守肽，这为AFM的诊断和治疗提供了新的思路，对于AFM的机理研究具有重要意义。
