科研 | INT J MOL SCI：比较转录组学研究揭示兰花颜色多态性（国人作品）
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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植物的颜色变化与适应性进化相关，兰花属Pleione具有各种各样的花色，但是其颜色形成及进化机制尚未得到解析。本文选择中国四川省黄龙市的P. limprichtii，该种群包括三种颜色的变化：玫瑰紫色、粉红色和白色，通过对不同颜色的分布模式、代谢组分析其色素物质、转录组表征其花色苷生物合成途径相关基因差异。研究结果为兰花颜色变化的分子机制提供理论证据，同时为探索兰花及其他开花植物中花朵颜色进化模型提供了相关数据支持。
论文ID
原名：Comparative Transcriptomics Provides Insightinto Floral Color Polymorphism in a Pleionelimprichtii Orchid Population
译名：比较转录组学为研究兰花的颜色多态性提供深入见解
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.183（2区）
发表时间：2019.12.30
通讯作者：刘仲健、吴沙沙
通讯作者单位：福建农林大学风景园林学院、兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室
DOI号：10.3390/ijms21010247
实验设计
选择中国四川省黄龙自然风景区的3个岩石种群的3种颜色的P. limprichtii，对不同颜色个体数量进行统计，手持式分光光度计测量5种CIE L * a * b *颜色分量并进行主成分分析。对盛开阶段的玫瑰紫色，粉红色和白色花朵的花瓣进行采样，提取RNA并进行转录组测序及RT-qPCR检测。进一步使用拟南芥的R2R3-MYB基因进行了系统发育分析，并利用MEGA7.0软件进行序列比对并构建环形系统树。利用String在线数据库（https://string-db.org/）搜索结构基因和转录因子之间的相互作用关系，并利用Cytoscape绘制共表达网络。采集样本研磨后4°C下用1.0 mL 70％甲醇水溶液萃取花瓣粉末，利用UPLC联合MS分析成分，利用Metware数据库及本地自建库分析鉴定花青素类化合物。
结果
1 颜色差异和数量分布模式
通过对随机分布在3个群落中的3种颜色的花朵个体进行定量统计，发现玫瑰紫色个体占近60％，粉红色个体占约30％，白色个体不超过10％（表1）。数量比约为6﹕3﹕1，玫瑰紫色是黄龙种群中的主要花色，而白色是最稀有的颜色。
表1 P.limprichtii开放阶段3个选定种群中每种花色多态性的个体数量。
根据主成分分析，3种颜色的a*（红色和绿色）值存在显着差异（图1）。3种颜色组的L*（亮度）和C*（色度）值的比较表明：C*值也可以用作区分这三种颜色的指标，因为玫瑰紫色组的C *值最高，白色组的C *值最低，而粉红色的组为中间值（表2）。
图1 P.limprichtii花瓣颜色的主成分分析。基于a*（红色和绿色）和b*（黄色和蓝色）的双变量值进行分布。 a*表示红色和绿色的差异，b*表示黄色和蓝色的差异 。
表2 P.limprichtii花瓣3种不同颜色的颜色参数。
RHS，皇家园艺学会彩色图表评估指数；L*，亮度；a*，b*色度分量；C*，色度（亮度）。
2 P.limprichtii主要花色苷化合物
UPLC分析显示，在有色和白色花瓣中均检出了四种花青素及其衍生物：氰基丁香3 -O-葡糖基-丙二酰基葡萄糖苷，花青素3-O-丙二酰基己糖苷，花青素和花翠素（表3）。ABP的花青素积累和花翠素积累分支表明花青素及其衍生物是主要的花色色素。
表3 P. limprichtii花瓣中花色苷含量。
3 RNA-Seq和单基因注释
为了了解花多态性的分子基础，RNA-seq分析颜色明显不同的花瓣和唇瓣。通过从头组装总共获得了80,525个平均长度为856 bp的单基因，且通量和测序质量足够高，可以用于下一步分析。
总共注释了33,724个单基因，占所有单基因的41.88％。其中，可以使用Nr数据库注释33,459个（占41.55％），使用Swiss-prot数据库注释21,177个（占26.30％），使用KEGG数据库注释11,067个（占24.68％），使用KOG数据库则为19,871（占13.74％）（图2）。
对Nr注释的E值特征的统计分析表明，32.05％的定位序列显示出很强的同源性（E值<1×10-3），而在Swiss-prot数据库中为29.48％，KEGG数据库为44.77％和KOG数据库为30.07％（图3）。
基于Nr注释，将6495个单基因分为53个功能类别，分别属于三个功能：分子功能、细胞成分和生物学过程。其中占最大百分比是生物过程中的代谢过程（3602单基因）、细胞成分中的细胞和细胞部分（2237和2233单基因）以及分子功能中的结合和催化活性（2481和3409单基因）（图4）。
11067个单基因定位到131个KEGG途径上，包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成、抗生素的生物合成以及许多其他重要的代谢途径。分别有2450和1294个单基因注释次生代谢产物的代谢途径和生物合成，而花色苷途径仅有1个单基因。在这131条途径中，有两种与颜色形成相关的途径：黄酮类生物合成途径（ko00941）包括36个单基因；ABP（ko00942）包括1个单基因。
4 ABP基因的表达模式
分离了与黄酮生物合成有关的基因和与颜色形成有关的ABP，包括结构基因和调节基因。结果显示有21种与ABP相关的结构单基因，编码10种酶，在有色花和白花中均表达，调控单基因包括14个R2R3-MYB、32个bHLH和23个WD40。关于结构单基因，除了单拷贝基因F3H、F3'5'H、ANR和FLS外，其余6个属于多基因家族（表4）。所有这些单基因都用于分析花色多态性的表达模式。
由于在不同颜色的花瓣中都可以检测到花瓣中的花色苷，因此推测花色差异是由ABP相关基因的不同表达模式引起的。结果表明，编码黄酮醇合成（FLS、PlFLS），花色苷合成（ANS、PlANS1、PlANS2）和UDP-葡萄糖花青素3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT、PlUFGT1、PlUFGT2）的基因在有色花朵中表达较高。玫瑰紫色和粉红色花朵要比白色花朵要高，玫瑰紫色花朵高于粉红色花朵（图5a和图6）。这些基因与花的颜色强度和颜色表型相关。除了这些直接影响的基因外，其他在色素花和白花之间具有不同表达方式的基因也影响颜色形成，例如黄烷酮3'-羟化酶基因（F3'H； P1 F3'H3）和二氢黄酮醇4-还原酶（DFR、PlDFR3），在玫瑰紫色花朵中均被上调，并有助于形成红色。
除此之外花色苷调节基因（包括R2R3-MYB、bHLH和WD40）的表达模式（图5b–d），系统发育分析（图7）显示，PlMYB13（unigene0062421）和PlMYB4（unigene0039181）与AtMYB75、AtMYB90和AtMYB113聚在一起，它们在拟南芥中激活花青素的积累，而PlMYB10（Unigene0058559）与拟南芥的AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111同源，控制黄酮的生物合成。PlMYB13的表达模式与花色苷的积累一致，而PlMYB10的表达与花色强度呈反比关系。
图5 基于P. limprichtii花青素生物合成途径相关基因和转录因子的RNA测序的表达模式分析。（a）花色苷生物合成途径相关的单基因；（b）bHLH 单基因；（c）R2R3-MYB单基因；（d）WD40单基因。 W-pe（白花的花瓣），P-pe（粉红色花的花瓣），R-pe（玫瑰紫色花的花瓣）。
图6. P.limprichtii中部分基因的实时定量逆转录PCR。
图7 P. limprichtii和拟南芥R2R3-MYB DNA结合结构域的系统发育分析。（a）圆形系统发育树；（b）扩增S4、S6和S7分支。
5 结构基因与TF之间的关系
通过分析ABP相关基因的表达模式和R2R3-MYB的系统树，获得几种与花色强度相关的候选基因。进一步构建共表达网络来识别ABP相关基因和MBW复杂蛋白（MYB、bHLH和WDR）之间的相互作用（图8）。结果表明，由2个R2R3-MYB、2个bHLH和1个WD40单基因组成的5个MBW复合转录单基因与10个结构单基因表现出相互作用关系。PlMYB10的表达模式与PlbHLH20（Unigene0062784）和PlbHLH26（Unigene00660）一致，而PlbHLH20和PlbHLH26也与PlWD40-1（Unigene0002153）相关。PlMYB10也显示出与PlFLS的线性关系。因此推断PlMYB10可能与PlbHLH20或PlbHLH26以及PlWD40-1相互作用以形成MBW转录复合物，并调节PlFLS的表达模式，最终影响P. limprichtii花多态性。
图8 花色素苷生物合成途径相关基因和色素沉着的转录因子的共表达网络。玫瑰紫色圆圈代表结构基因；深灰色圆圈代表R2R3-MYB；浅灰色圆圈代表bHLH；粉色圆圈代表WD40。
讨论
为了探索颜色变化的形成因素，使用了CIELAB评估系统来区分玫瑰紫色、粉红色和白色花朵的颜色，然后计算每个种群中每种表型的个体数量。在所有三个种群中，颜色分布模式几乎是一致的，颜色比率为玫瑰紫色6﹕粉红色3﹕白色1。这种分布模式在自然颜色多态种群中非常罕见。研究表明种内花的颜色变化通常与遗传漂移、授粉介导的选择、环境条件等因素相关。本实验中整个种群都分布在相似的岩石上，并处于相同的气候条件下，因此诸如温度、紫外线辐射等环境因素并不是颜色变化的关键促进因素。授粉媒介介导的选择在颜色变化中起着重要作用，特别是对于欺骗性授粉物种，在竞争性授粉中授粉媒介的竞争促进了花朵颜色的分布，而授粉媒介的转移也促进了花朵颜色的宏观进化。因此，研究者推断这些种群中的花色多态性可能是由传粉媒介诱导的。颜色多态性可能是授粉竞争或对传粉媒介的特定适应的结果，而传粉媒介的行为会对颜色变化产生强烈的选择压力。一些研究还显示了对有色花朵的自适应选择，因为无色花朵更容易被植物破坏。根据实地观察，研究人员发现白花的个体比有色花的个体更容易受到损害，并且开花时更多的白色花被觅食。有色色素有助于避免食草动物的觅食，并减少食草动物对种群的损害。当个人受到伤害时，它们对传粉媒介的吸引力也会降低，这不利于种群的稳定和发展。这解释了种群中玫瑰紫色花朵数量的分布方式。还有一种观点认为花的颜色可能不是自然选择的主要目标，也不是传粉媒介的最初选择。色素物质的生物合成相关化合物还具有其他生理功能。研究表明，与植物防御功能相关的次生代谢产物具有相同的生物合成途径，即类黄酮合成途径，表明色素与防御能力相关。综上所述，种群中玫瑰紫色花朵多而白色花朵少的现象可能是由传粉媒介和草食动物介导的，并且也与P. limprichtii生存适应性有关。颜色多态性的6：3：1分布模式可能是维持最大种群密度的种群繁殖策略，但仍需要进一步研究证据。
从有色花到白花的转变可能涉及任何阻止花色苷途径中一个或多个步骤的突变，包括任何途径酶编码基因中的功能丧失突变，以及影响其顺式调控基因。在本研究中，表达分析确定了花瓣中几个明显的差异表达基因，与有色样品相比，这些基因在白色样品中被下调，但代谢物检测发现白色花瓣和有色花瓣中都存在Cy和Del衍生物，这表明颜色变化，尤其是白色花瓣，不缺少花色苷途径的任何步骤，而转录因子的顺式调节是促进颜色差异的关键因素。此结果与Primula vulgaris的白色花形成机制相似，是由不同的基因表达模式引起的，而不是花色素苷功能基因缺失导致的。
分析得到10个与ABP相关的基因编码的蛋白，其中7个是类黄酮合酶基因，1个是原花青素合酶基因，大多数是多基因家族。进一步分析结构基因的表达模式表明，白色花瓣中PlCHS和PlCHI的表达水平很高，而有色花瓣中的表达水平较低，这表明白色花瓣可以产生大量的柚皮苷，但不能将其转化为花色苷。同时，与白色花瓣相比，有色花瓣中PlF3'H、PlF3'5'H、PlDFR、PlANS和PlUFGT的表达水平较高，表明其对着色的贡献很大。分析还显示，与有色花瓣相比，白色花瓣中的PlFLS显着上调。FLS编码的蛋白将底物引入黄酮和黄酮醇途径，FLS酶上调会导致流向黄酮醇的代谢通量增加，同时限制了花青素的积累，在其他物种中也有这种情况的报道。因此PlFLS是在P. limprichtii中形成白色的候选基因之一。有色花中PlDFR的上调与PlFLS的下调密切相关，推测在有色花朵中更多的二氢黄酮醇流入花色苷合成途径中。根据分析，PlANS和PlUFGT的表达模式与颜色强度相关，在玫瑰紫色花朵中表达水平最高，在白色花朵中最低。ANS（花色素苷合酶）编码的蛋白催化无色的花色苷转化为有色的花色素苷，花色苷进一步被不同的UFGT（UDP类黄酮葡糖基转移酶）编码酶糖基化，将花色素苷转化为不同的花色苷衍生物，显示出最终的颜色。因此，研究人员推测，PlANS和PlUFGT是2个决定P. limprichtii颜色的重要基因。
已有研究表明MBW蛋白复合物（R2R3-MYB和bHLH转录因子的组合）与WD40蛋白在调节结构基因的转录中起着重要作用。R2R3-MYB因子的活性促进或抑制花色苷生物合成基因的转录。通过结合R2R3-MYB的系统发育和共表达网络分析，研究者发现PlMYB10与拟南芥S7的有助于调节花青素积累的基因AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111同源，且表达模式随着颜色强度的增加逐渐降低。共表达网络显示PlbHLH20和PlbHLH26以及PlWD40-1与PlMYB10有很强的关系。这种潜在的MBW复合物PlMYB10/PlbHLH20/PlWD40-1或P1MYB10/PlbHLH26/PlWD40-1可能充当阻遏物，对颜色强度产生影响。共表达网络揭示了PlFLS是最可能与PlMYB10相互作用的靶基因。先前的研究也证实，R2R3-MYB可以通过在拟南芥中过表达PsMYB114L来调节FLS的表达模式，这与本研究结果一致。基于以上分析初步推测了P. limprichtii的ABP（图9）。
图9 P. limprichtii颜色变化的假定途径。彩色条是使用颜色深度表示的log2值（RPKM + 1），紫色表示上调的表达基因，粉红色表示下调的表达基因。
结论
黄龙地区种群中P. limprichtii的颜色分别为6﹕3﹕1，推测与传粉媒介、草食动物和生存适应性相关。功能和表达模式表明，PlFLS可能是白色和有色花朵形成过程中的关键基因，PlANS和PlUFGT确定花的颜色强度。另外，MBW复合物PlMYB10/PlbHLH20/PlWD40-1或PMYB10/PlbHLH26/PlWD40-1可能是调节PlFLS表达的阻遏物，导致P. limprichtii的颜色强度变化。
评论
花的颜色是自然界植物最吸引人的特征之一，对植物进化发挥重要的作用，且促进了种群多态性的形成，是生态、进化及基因调控的模型。本研究调查了黄龙地区P. limprichtii的颜色多态性个体的分布，并结合HPLC检测和转录组学分析来鉴定主要色素化合物并确定影响花色的候选基因，最终提出了一个假定的花色相关物质的生物合成途径及其调控机制。研究结果为P. limprichtii花卉颜色变化提供了有价值的分子信息，也为进一步探索颜色多态性、物种进化之间的关系及其对颜色进化的贡献提供了启示。
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