编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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导读
LFS综合征（Li-Fraumeni syndrome）是癌症的一个分类病症，是一种罕见的常染色体显性遗传病，它主要是由于一个抑癌基因p53的缺失，引起家族性不同类型癌症的发生，这些癌症包括乳腺癌、脑瘤、恶性肉瘤和骨癌等。近日，研究人员对乳腺癌和肉瘤患者的TP53变异体进行了直接的基因分型，发现该Tp53变异体增加了软组织肉瘤的发生风险，但降低了乳腺癌的发生风险。在随后的研究中，研究人员评估了TP53变异体小鼠不同器官组织的肿瘤发生情况。结果发现，该变异体小鼠增加了一个在脑中高表达的miR-382的靶向位点，同时使在乳腺组织中高表达的miR-325的靶向位点受到削弱。相对野生型小鼠来说，p53基因在多种类型的小鼠乳腺组织中上调，而在大脑中表达下调，这些有可能与这两个miRNA的差异化表达有关。总之，本研究发现TP53变异体在乳腺癌发生风险方面与LFS突变体不一致，但与LFS突变体对胶质瘤的易感性相一致，揭示了一种由miRNAs介导的组织特异性肿瘤易感性的潜在机制。
原名：Tissue-specific microRNA expression alters cancer susceptibility conferred by a TP53 noncoding variant译名：组织特异性的microRNA表达改变了TP53非编码变异所赋予的癌症易感性期刊：Nature Communications（2区）通讯作者：Zhongxin Lu & Yong Li作者单位：美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院、美国俄亥俄州勒纳研究所癌症生物学系、武汉市中心医院为了确定TP53非编码变异与乳腺癌和肉瘤风险的关系，研究人员在中国汉族成人乳腺癌(n=2373)或肉瘤(n=130)和正常对照(n=9972和8947)中进行了rs 78378222基因分型（表1）。对照组的次等位基因频率(MAFS)为0.017-0.018，与以前的报告相当。研究人员观察到rs78378222[C]与肉瘤风险之间存在显著相关。该风险限于软组织肉瘤，因为没有骨肉瘤患者携带该变体。与之形成鲜明对比的是，这个TP53变体可以预防乳腺癌。表1 乳腺癌和肉瘤与 rs 78378222[C]的关系为了研究该变异体在癌症中的致病机理，研究人员构建了一株带有Trp 3基因的小鼠细胞系，该细胞系携带另一种PAS。研究人员将合成的Trp 53等位基因命名为Trp 531755C(缩写为p53C)，因为小鼠p53参考mRNA的第1755号碱基是人rs78378222的直系同源物。动物的遗传背景为C57BL/6。携带p53C等位基因的小鼠生存期短于野生 p53+/+小鼠(图1a)，杂合子(p53+/C)小鼠的中位生存期为108周，纯合子小鼠(p53C/C)的中位生存期为102周，但存活率比p53+/−小鼠长（平均存活率约为70周）。p53+/C和p53C/C小鼠的存活曲线接近，但p53+/C小鼠的存活率优于p53C/C小鼠(P=0.017，图1a)。多态小鼠肿瘤的发生频率高于野生对照组。B细胞恶性肿瘤是p53+/C和p53C/C小鼠（无胸腺淋巴瘤发展）中最常见的肿瘤(图1b-e)。多形性小鼠淋巴瘤的外显子组测序显示所有肿瘤中都有p53编码的体细胞突变，p53和Gapdh接近1:1。补充表3中有几个p53突变类似于人类热点TP53致病突变，虽然研究人员没有使用功能测试来测试这些突变体，但它们中的大多数是很可能是致病的，而另一些可能是不确定的意义的变体。首先，存在两个无义突变的突变，其将导致截短的和无功能的p53蛋白缺乏DNA结合域、四聚结构域和极端羧基末端。其次，P38T是两个肿瘤中唯一的复发性突变。这个p残基位于一个富含脯氨酸的区域，它对p53的转录活性至关重要，在人、鼠、鼠、狗、猕猴和鸡中都是保守的。最后，在p53蛋白的DNA结合域中出现了另外4种突变体，可能破坏p53 DNA相互作用。照射进一步缩短了p53多态小鼠的存活时间，增加了癌相关死亡，增加了胸腺淋巴瘤的发病率。照射p53+/+、p53+/C和p53C/C小鼠的中位生存期分别为104、93和85周。这些数据表明，这种p53非编码变异增加了恶性肿瘤的风险，缩短了生存期。TP53是唯一一个导致罕见的单基因孟德尔病（LFS）的基因，该病包括大幅增加的发生胶质瘤的风险，以及具有与胶质瘤风险增加较小相关的共同遗传的SNP（rs78378222）。胶质母细胞瘤（GBM）是最高级别的星形细胞瘤，这种TP53变异体可同时诱发GBM和非GBM胶质瘤。大约30%的GBM肿瘤表现出前神经基因表达模式，其特征在于频繁的Tp53突变和PDGFRA突变和/或过表达。研究人员采用了一个由PDGF驱动的GBM小鼠模型，通过将表达PDGFB的逆转录病毒注入脑亚心室区(SVZ)中，该模型具有前神经基因表达模式。接受逆转录病毒的p53和/或小鼠具有最早的肿瘤发病，且所有死亡均发生胶质瘤在 40天内，而p53+/-小鼠存活至150天（图1f)。所有p53C/C小鼠在45-260天时死于胶质瘤，但p53+/C和p53+/+小鼠都被杀死时，到275天时都没有表现出任何脑部病变。p53C/C小鼠肿瘤具有高度浸润性和侵袭性，广泛的血管化和坏死(图1g)，均为GBM的组织学特征。这些肿瘤广泛表达标记物 GBM干细胞与上皮间充质转化(EMT)(图1h-k)。以剂量依赖性的方式将肿瘤细胞移植到同基因免疫受体小鼠体内，进一步证实了肿瘤细胞的恶性表型(图1l)。这些数据支持TP53变异体在胶质细胞瘤发生中是致病性的。为了探讨这种TP53变异体在乳腺癌发病中的作用，研究人员首先将P53+/C小鼠与表达由小鼠乳腺癌病毒长端重复序列(MMTV)启动子驱动的多瘤病毒中间T抗原(PyVT)的小鼠杂交。PyVT小鼠是FVB背景。研究人员研究了第一代子代(F1)乳腺肿瘤的发生。杂交小鼠(50：50 C57BL/6与FVB背景)，F1小鼠与p53+/C小鼠交配产生的F2代(75：25 C57BL/6与FVB背景)。令研究人员惊讶的是，p53+/C；PyVT F1Fe 雄性小鼠患较小而较少的乳腺癌，存活时间超过p53+/+；PyVT F1小鼠(图2a-c)。研究人员用全分子显微镜检测了乳腺上皮细胞的癌前转化，发现p53C等位基因可将上皮增生的发育推迟到8周左右，而p53+/+；PyVT则为4-6周(图2d)。在F2中 p53C/C；PyVT和p53+/C；PyVT小鼠的无瘤生存期均明显长于p53+/+；PyVT小鼠(图2e)。β-酪蛋白和E钙黏蛋白的高表达表明，与p53+/+；PyVT小鼠的肿瘤相比，多态小鼠的肿瘤分化程度更高，EMT的表达也更少。图2 p53C延迟了小鼠PyVT- 和 Errb2-介导的乳腺癌的发生由于大多数在LFS女性中发生的乳腺癌是ERBB2阳性的，接下来研究人员交叉p53+/C小鼠，在FVB背景下过度表达MMTV驱动的ERBB2，并检测乳腺癌在 F1杂交小鼠中(50:50C57BL/6至FVB背景)的发生情况。类似地，p53+/C；ERBB2小鼠的无肿瘤存活率高于p53+/+；ERBB2小鼠，而p53+/+；ERBB2小鼠无瘤生存时间最短（图2f)。来自p53+/C的肿瘤；ERBB2小鼠表达的E钙黏蛋白和泛角蛋白(pCK)的水平高于p53+/+；ERBB2对照，p53多态小鼠上皮起源与肿瘤进展的关系。与p53/；ERBB 2小鼠相比，ERBB 2小鼠有较少的肺转移。肺组织中每只p53+/C；ERBB 2小鼠的肺转移瘤较p53+/+；ERBB 2小鼠少且较小。在多形性或野生 p53小鼠乳腺癌中，p53蛋白染色较强。5例乳腺癌中p53基因序列分析各组标本均携带p5 3杂合子编码突变，证实乳腺癌发生需要功能增益突变。研究人员分析了p53在各种组织中的表达和激活。p53蛋白和mRNA水平，以及在照射时的蛋白质磷酸化，p53C/C小鼠的脑、结肠和脾脏均低于野生小鼠(图3a-c)。p53蛋白在p53C/C小鼠脑组织中的表达明显低于p53+/+小鼠(图3a)。观察到胶质细胞瘤发生(图1f)。相反，p53C/C小鼠乳腺中p53表达高于野生小鼠。从小鼠组织中的总RNA中提取cDNA 经测序，p53C/C小鼠的p53C等位基因在脑中被p53+/+小鼠的p53A等位基因超过，而p53C等位基因在乳腺中的数量大于p53A(图3d)。研究人员在TP53启动子驱动的EGFP或RFP(EGFPC和RFPA)下游克隆了全人TP53 3'UTR(A等位基因，TP53A)或3'UTR(带有替代PAS(C等位基因，TP53C))。将这两种结构导入细胞，检测EGFP和RFP的表达。在U87胶质瘤细胞中EGFPC mRNA的表达低于RFPA，而在MCF10a与乳腺癌MDA-MB-231细胞中则相反（图3e）。当EGFP/RFP被TP53编码序列取代时，A等位基因导致p53表达高于U87中C等位基因，而非MCF7细胞(图3f)。因此，该变异导致p53上调或下调，依赖于组织或细胞环境。图3 在组织和细胞系中，p53C等位基因对差异p53下调作用。由于该变异体对p53有一定的调控作用，因此研究人员怀疑miRNA的表达是多态小鼠不同程度解除p53调控的决定因素之一。miR-325的靶向mRNA是自身TP53 3’UTR，miR-382在人和小鼠中通过PAS变体靶向TP53 3’UTR(图4a）。miR-325和miR-382的表达在不同的人体组织中有显著差异，其中miR-325在乳腺中高表达，miR-382在大脑中高表达。miR-325：miR-382在大脑中最低，在人类(图4b)和小鼠(图4c)中乳腺/乳腺中最高。和miR-325一样，另外三种miRNAs都是以TP53A为靶标的，在人类乳腺组织中也有较高的表达。p53C等位基因本身并没有改变miR-325或miR-382在大脑、乳腺和其它组织。接下来，研究人员检测了这两种miRNAs在几种人类细胞中的表达：U87胶质瘤细胞和HCT116结肠癌细胞的miR-325：miR-382最低。与MCF10a、MCF 7和其他两个乳腺癌细胞系比较(图4D)。然后测定miRNA对这些细胞内源性p53的调控作用。miR-382抑制 p5 3蛋白在u87和HCT116细胞中的表达高于miR-325，而在MCF7和MCF 10a细胞中的表达则相反，其内源miR-325水平较高(图4e)。同样，miR-325抑制导致p53蛋白的表达高于miR-382在p53+/+MEFs中的表达，而p53C/CMEFs的结果相反(图4f)。研究人员在MEFs中加入miRNA模拟物，发现miR-325在p53+/+ MEFs中下调p53的程度大于miR-382，而miR-382则比miR-325在更大程度上下调p53在p53C/C MEFs中(图4f)。在具有外源性TP53A的人细胞中，miR-325比miR-382下调p53蛋白的水平；而在TP53c的细胞中，miR-382下调p5 3蛋白的水平大于miR-325。在随后的试验中，miR-382表达的调控对TP53C驱动的活性影响比miR-325更大，而对模块的影响更大。 miR-325的表达对TP53A驱动活性的影响大于miR-382调节。综上所述，这些数据表明miR-325比miR-382更有效地靶向A等位基因，而miR-382比miR-325更有效地靶向c等位基因。为了检测miRNA靶向位点(即PAS及其相邻核苷酸)的贡献，研究人员克隆了由SV40 3’UTR上游的人类TP53启动子驱动的TP53编码序列。无论是野生 PAS（A）还是PAS变体（C），两者都不是miR-382的目标。这两个质粒共转染5个细胞系，并构建了p53活性报告结构。与miR-382的内源水平无关，所有具有野生 PAS的5个细胞系显示出比具有替代PAS的p53活性更高的p53活性。接下来，研究人员利用携带野生 PAS(A)或PAS变体(C)的TP53 3’UTR产生表达EGFP的质粒。研究人员对PAS(M4)下游的4个核苷酸进行突变以消除miR-382靶向点。在内源性miR-382水平较高的U87细胞中(图4d)，A等位基因的表达高于C等位基因。当miR-382：TP53 3’UTR(C)被破坏时，M4C等位基因的细胞EGFP表达高于M4A等位基因的细胞。这些结果支持miR-382结合位点的完整性对于miR-382介导的TP53C的抑制是必不可少的。为了进一步测试TP53A/TP53C和miR-325/miR-382之间的直接相互作用，研究人员使用转染生物素化RNA片段和链霉亲和素珠的H 1299细胞进行了pull-down试验，使他们的结合。首先，以含有miRNA结合位点的生物素化TP 53 3'UTR片段为诱饵，共同纯化潜在的结合miRNAs。含有本机TP53 PAS的片段比miR-382减少的miR-325要多，而包含替代PAS的片段比miR-325减少的miR-382要多；当miR-325的结合位点时。miR-325，miR-382，或两者都发生了变异，相应的片段无法将miR-325、miR-382或它们中的任何一个拉下来。第二，利用生物素化的miRNAs进行协同作用,将转染含有TP53 3'UTR的TP53 3’UTR的转染H 1299细胞的外源3'UTR，或带有野生或突变miR-382靶向位点的替代PAS。这四个质粒产生了相似的3'UTR水平。生物素化miR-325比miR-382更有效地降低了野生 3'UTR，而miR-382则比miR-325更有效地降低了3’UTR,消除miR-382的结合位点完全阻止3’UTR与miR-382共纯化。这些实验为支持TP53A/TP53C与miR-325/miR-382之间的直接结合提供了新的证据。接下来，研究人员改变了miRNA在小鼠大脑和乳腺的表达，并评估了肿瘤发生的变化。研究人员选择miR-382，因为它比miR-325的表达量要高，并且没有像miR-325那样的有直系同源物。首先，研究人员在p53+/+;Erbb2 或 p53+/C;ERBB 2的F1小鼠乳腺内注射了一种高表达miR-382的逆转录病毒65周，miR-382显著加速了p53+/c，ERBB 2小鼠中中的乳腺肿瘤发展，但对p53+/+；ErbB2小鼠具有较小的影响(图4g)。p53+/+；ERBB 2或P53+/C；ERBB2小鼠感染对照病毒后未发生肿瘤。miR-382在乳腺中过表达，p53+/C；ERBB 2小鼠的无瘤生存期明显短于p5 3+/+；ERBB 2老鼠(图4g)，与未治疗的老鼠形成鲜明对比(图2f)。在肿瘤出现前，p53+/C、ERBB 2小鼠乳腺中miR-382高表达，与p53+/+,ERBB 2小鼠相比，ERBB 2小鼠促进乳腺上皮生长(图4h)。紧接着，研究人员将过表达PDGFB和抑制剂的逆转录病毒注射入p53C/C小鼠的SVZ中。那些接受PDGFB和miR-382抑制剂的p53C/C小鼠延长了存活, 与接受PDGFB和对照抑制剂(或miR-325抑制剂)的小鼠进行比较(图4i)。这可能是由于miR-382抑制导致p53在p53C/C小鼠靶部位上调所致。这些数据表明，调控p53C靶向miR-382的表达改变了p53C多态小鼠大脑和乳腺的肿瘤发育。图4 组织特异性miRNA表达导致不同的p53调控遗传性癌症易感性的结构是对一般人群中具有不同风险和流行程度(即等位基因频率)的易感等位基因的构成。在频谱的一端是非常罕见的高外显突变体，导致孟德尔病，所有这些都位于肿瘤抑制基因的CDS中(例如TP53基因在LFS中的种系突变)。他们的MAFs通常为≤0.01%，癌症风险的优势比ORs高达20。几乎所有的家族性癌症综合征都是由这些生殖编码突变引起的。在另一端，低外显易感性等位基因MAFS>5%，OR值为1.1-2.0。这些低外显等位基因中，绝大多数位于非编码区，即使不是数千个，也有数百个。在人类基因组中，研究人员对生物学结果和癌症之间因果关系的理解是粗略的。与其他GWAS多态性相比，TP53非编码变异体(rs 78378222[C])在癌症易感性、组织特异性和致病性方面是非编码的。首先，它与多种癌症的风险增加相关，MAF为0.1-1.92%，OR范围为1.39-4.55。鉴于今年世界人口估计将达到77亿，假设MAF为1.0%，这种变异的特征将使全世界1.5亿面临癌症风险的人受益。其次，它作为TP53在中国人群中的一种变异体，可以保护最常见的LFS肿瘤类型的乳腺癌，并增加患软组织肉瘤的风险，而软组织肉瘤是第二常见的LFS肿瘤类型。p53C变异延缓乳腺肿瘤的发生在两种小鼠模型。第三，与其他可能破坏miRNA结合的细菌系变异体相比，它是真正的致病性的。关于DISR多态性的研究有很多种，在癌基因的3’UTR miRNA结合位点(如BRCA 1、ESR 2和KRAS )上插入编码序列或多态性的miRNA。其中，sKRAS LCS6位于let-7 miRNA的互补区中。 KRAS癌基因的3’UTR内的一个互补位点是研究最多的基因之一。然而，KRAS LCS6变异体的临床用途自最初公开以来一直受到严重质疑。有研究显示它与肺癌，乳腺癌和卵巢癌相关。在有史以来最大的一项研究中，共有140012名人类受试者，KRAS LCS6变异体并没有增加卵巢癌或乳腺癌（在不考虑乳腺癌1/2的情况下）的风险；对于卵巢癌、乳腺癌和其他所有以前报道过的与这些癌症的总生存期的关联，也得到了无效的结果。除了该TP 53变体之外，使用动物模型验证了可能与miRNA相互作用的癌症基因中的少数多态性。因此，在本研究中确定TP53变异体的致病作用有助于研究人员理解低外显率低频率的非编码癌易感位点。研究人员将携带rs 78378222[C]的癌症患者与LFS患者进行比较。rs78378222[C]与LFS突变体在几个方面不同：突变位点(超过100个位点对单个核苷酸)、肿瘤突变点(包括乳腺癌和保护性乳腺癌)、外显(高和中度)以及受影响人口的数量（可能多达1.5亿人) (表2)。另一个差异是性别对癌症的影响：LFS患者的终生癌症风险估计为73%，女性为100%，乳腺癌的风险较高。性别的影响对癌症可能不存在，甚至可能在携带这种变异的患者中被逆转，这会导致前列腺癌的风险和乳腺癌的保护。最后，不同的miRNAs 参与了LFS突变体和非编码变异体对肿瘤易感性的调控。p53靶基因miR-34A启动子的相对低甲基化存在于外周血细胞中。LFS患者与野生型TP53患者相比，miR-34A启动子甲基化在肿瘤中检测到，而在LFS患者的正常组织中未检测到。这些结果支持miR-34A在个体间癌症易感性中的作用，但其因果关系尚未被研究。另一方面，这项工作提供了一个差异表达和调控个体内组织特异性肿瘤易感性的miRNAs。这项研究表明miRNAs的差异表达降低了A的表达，一个组织中的致病性遗传变异增加了它在另一个组织中的表达，并且至少部分地促进了同一个体组织特异性癌症的易感性。总的来说，这些差异特别是这些患有非编码变异体的患者免受乳腺癌的影响，反对将rs 78378222称为LFS变异体。在符合描述的家族中发现的癌症簇的临床样本中危险人群应考虑rs 78378222基因分型和与LFS不同的潜在靶向性癌症监测方案。本研究的优点是使用直接基因分型来确定癌症易感性，而不是遗传诊断。另一个优点是，该变异体在癌症风险和保护方面的生物学可行性在使用多个小鼠模型和分子细胞分析进行了广泛地探究和确定。然而，研究人员的研究也有几个局限性。首先，软组织肉瘤的病例数量相对较小。其次，癌症的易感性可能存在某些物种或种族的差异。在SVZ中，p53+/c小鼠不发育具有PDGFB过量表达的神经胶质瘤。p53C等位基因在两种小鼠模型中延迟了乳腺肿瘤形成。值得注意的是，虽然使用的同品系小鼠，研究人员不能排除与C57BL/6株p53C等位基因相关的一个或多个基因影响乳腺癌风险降低的可能性。在这项针对中国人群的研究中，该变异体对乳腺癌有保护作用，但在欧洲人群中，这种变异与乳腺癌之间并没有具体的关联。这可能是由于SNP移植的不准确或乳腺癌保护中种族特异性的差异所致。第三，在这里也有许多悬而未决的问题有待解决。携带TP53C/C患者和携带该变异体的儿童和青少年发生了哪些类型的肿瘤？p53变异体对头颈部鳞状细胞癌的保护作用背后是否有miRNAs的参与？p53在某些组织中是否有一定程度的上调，从而使载体表现出核糖体病或电荷综合征的中度征象，在p53被不恰当激活的时候？从种群遗传学和小鼠模型的进一步研究将揭示并证实与这种非编码变异相关的更广泛的疾病谱，这种变异可能影响到全世界多达1.5亿人。
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