Theranostics综述 | 重庆大学：基于RNA的骨再生支架：mRNA，miRNA和siRNA的应用及其机理（国人佳作）
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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骨骼是一种复杂而动态的组织，具有出色的再生能力。然而，大的或不稳定的骨折不利于成功愈合，并且在其再生之前需要额外的治疗。组织工程使用特定的三维（3D）结构生物材料（通常称为“骨骼支架”）来替换和修复缺陷，并克服了自体和异体移植物的局限性。当前，通过加工天然和合成生物材料，可以容易地获得支架，并设计具有不同几何形状的支架以治疗骨缺损。另外，为了增强骨再生，可将细胞或药物添加到支架中并一起递送至骨缺损部位。令人兴奋的是，在过去的几十年中，基于RNA的疗法已越来越多地用于修复骨缺损，因为人们对分子机制有了更加深入的理解，例如包括分子触发，信号分子和转录调节因子等的基因调控网络。 基于多种多样的RNA分子家族，已经开发出多种用于骨骼再生的RNA治疗剂，包括信使RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。当将不同的基于RNA的疗法与不同的支架组合使用时，可以通过多种机制在RNA水平上增强骨缺损的修复。lncRNA的主要机制涉及在成骨过程中通过竞争性内源性RNA（ceRNA）与miRNA的结合间接调控基因。但是，lncRNA的使用仅限于在骨组织工程中用少量转染的细胞进行探索，因此在本综述中没有详细描述和讨论。
在过去的几十年中，随着分子技术，纳米技术和新型生物材料的使用不断发展，治疗性RNA可以轻松合成，传递至骨骼并根据特定需求进行修饰。尽管裸露的RNA分子已用于修复骨相关疾病，但RNA的不稳定性阻碍了其使用。因此，RNA的修饰是有益的。通常，已经使用两种方法将RNA递送至骨组织，即系统递送和局部递送至骨部位。两种普遍应用的全身递送方法是病毒载体和非病毒纳米颗粒。局部递送至骨缺损部位主要利用非病毒生物相容性支架，该支架具有内在的优点，但也显示出一些缺点。目前，尚无系统地总结这些基于RNA的生物材料在局部递送中的作用的研究。因此，本综述将讨论三种类型的RNA的机制，即mRNA，miRNA和siRNA，重点是根据使用的不同支架对这些RNA递送系统的分类以及对临床试验和治疗应用的描述这些RNA输送生物材料在骨缺损修复领域的应用。
论文ID
原名：RNA-based scaffolds for bone regeneration: application and mechanisms of mRNA, miRNA and siRNA
译名：基于RNA的骨再生支架：mRNA，miRNA和siRNA的应用及其机理
期刊：Theranostics
发表时间：2020.2.10
影响因子：8.063
通讯作者：吕永钢教授
通讯作者单位：重庆大学生物工程学院
DOI号：10.7150/thno.42640
结果
1. 基于mRNA的骨修复疗法
用于骨缺损修复的mRNA制备：mRNA是一种单链核糖核酸，从一条DNA转录而来，起着模板的作用，并携带遗传信息来指导体内真核细胞中的蛋白质合成。体外转录mRNA（IVT mRNA）而非内源性mRNA具有修复骨缺损的巨大潜力，代表了一种新的药物类别。使用IVT mRNA可避免由于质粒DNA（pDNA）转染而引起的核膜阻塞，而质粒DNA（pDNA）的转染效率不高，无法进行基因治疗。 mRNA不一定要进入细胞核才有效，这不仅避免了由核膜构成的屏障，而且在非有丝分裂细胞中也产生了更高的效力。而且，与pDNA不同，引入mRNA后没有基因组整合的风险，而且mRNA没有免疫原性的CG岛基序。这些问题仍然是基于DNA的基因治疗的主要问题。mRNA的优异特性确保了通过基于mRNA的治疗可获得高效，可控制和快速开始的治疗性蛋白表达。体外转录mRNA需要模仿细胞内转录环境。通常，IVT mRNA是从线性化的pDNA或带有噬菌体启动子，5´非翻译区（UTR），开放阅读框（ORF），3´UTR和可选的poly的聚合酶链反应（PCR）模板转录而来[d（A / T）]序列。由于包含氢氧自由基和周围的核酸酶，mRNA的不稳定性引起了人们的关注。毫无疑问，戴帽结构，5´或3´UTR，ORF或mRNA的其他部分中包含化学修饰的核苷酸为确保mRNA的稳定性和可翻译性提供了理想的解决方案。
mRNA传递至骨相关细胞：1969年，mRNA首次成功在体外转录。这似乎可用于疫苗开发，癌症的免疫治疗以及各种其他疾病的治疗。可以通过物理方法（电转染，基因枪或显微注射和化学方法（阳离子聚合物，脂质体，脂质体纳米颗粒等）实现将mRNA传递至细胞质的过程。例如，电穿孔被认为是将mRNA直接递送到细胞质中的一种非常有效的物理方法，这是通过向细胞膜上施加电脉冲使mRNA进入细胞质而实现的。然而，到目前为止，由于高成本和体内递送的不便，很少有研究报道在骨组织工程中使用这些技术来实现mRNA的递送。与物理方法相比，化学方法具有其低成本，易用性和多功能性等特点，在骨缺损修复中的应用已得到广泛探索。在化学载体中，阳离子聚合物，脂复合物和脂质纳米颗粒已主要用于基于mRNA的骨组织工程中。例如，阳离子聚合物聚-L-赖氨酸（PLL）和聚乙烯亚胺（PEI），两种典型类型的带正电荷的阳离子聚合物，可以与带负电荷的mRNA结合形成可被细胞吸收的纳米颗粒通过内吞作用。在递送到细胞质方面，PEI比PLL更有效，而PLL没有导致可检测的mRNA翻译。另一个重要的载体是脂质复合物纳米颗粒（或其衍生物），已用于多种mRNA递送方法。将核酸（负电荷）与阳离子脂质体（正电荷）混合后，这些成分将通过静电相互作用自发组装成多相复合物。纳米颗粒具有多种形式，例如多链体，脂质体，脂质纳米颗粒（LNP），树状聚合物，无机纳米颗粒和杂化纳米颗粒。在最近的一项研究中，研究人员开发了改进的可生物降解的脂质纳米颗粒，以将mRNA递送至肝脏以进行CRISPR / Cas9基因编辑，从而以高达90％的效率准确地改变了细胞的遗传密码。总之，脂质复合物纳米颗粒是迄今为止报道的最有效的mRNA传递工具，可以克服许多技术障碍。其他阳离子聚合物已在先前的评论中讨论过。
mRNA传递至骨缺损部位：mRNA在制备肿瘤疫苗、癌症免疫疗法、药物递送、皮肤修复、心肌损伤修复和再生医学等领域中具有优越的性能。然而，直到2015年，Elangovan等人才发现mRNA在骨组织工程中的巨大潜力，他首先使用mRNA与组织工程支架相结合来修复骨缺损，从而为骨再生开辟了新途径。无论在哪个领域，mRNA应用的主要限制之一是免疫原性，为了降低mRNA的免疫原性，Elangovan等通过用硫代糖基化的鸟苷和甲基化的胞嘧啶取代鸟苷和胞嘧啶修饰了mRNA编码区的核糖核酸三磷酸，修饰的mRNA称为cmRNA。如前所述，cmRNA的免疫原性低于未修饰的或25％修饰的mRNA。随后，将编码骨形态发生蛋白2（BMP-2）的cmRNA和PEI的复合物与胶原蛋白支架相结合，以修复大鼠颅骨缺损。正如预期的那样，cmRNA修饰的支架显着加速了骨再生的过程，而pDNA修饰的支架对骨愈合的作用有限。通过使用这种方法，Elangovan等人通过证明cmRNA修饰的支架在此类组织中的功效，完美地展示了cmRNA修饰的支架在骨组织工程中的强大潜力。基于这项研究，Elangovan小组成员进一步比较了与胶原蛋白支架静电相互作用后，编码BMP-2的cmRNA和编码BMP-9的cmRNA促进大鼠颅骨缺损的再生。 BMP-9-cmRNA的骨诱导能力强于BMP-2-mRNA，这与人们普遍认为BMP-2是临床上有用的治疗分子背道而驰。当然，他们的结果缺乏足够的证据来完全证明BMP-2的有效性。随后，张等人设计了一种新的mRNA，该mRNA删除了5'-UTR的上游开放阅读框和3'-UTR的富含AU的管道聚腺苷酸化元件。 5-碘修饰的嘧啶核苷酸也作为短UTR（TISU）的翻译起始物引入了mRNA，在增强新骨形成方面显示出显着优势。改进的cmRNA似乎具有较低的免疫原性。但是，mRNA的释放持续时间是影响mRNA在骨骼再生中应用的关键问题之一，以前的研究似乎并未考虑。即使当它显示出低的免疫原性时，仍然迫切需要提高mRNA的稳定性并延长其作用。普朗克实验室致力于研究高级磁性脂质体转染载体。一方面，假定使用具有高转染效率的这些先进载体来递送成骨相关mRNA可以促进骨缺损部位的骨形成。另一方面，与具有修饰的核糖核酸三磷酸的mRNA相比，线性化模板的使用导致翻译效率的不同。在双重重塑下，脂质体和磁性脂质体被用于向大鼠脂肪间充质干细胞（AMSC）或骨髓间充质干细胞（BMSC）输送增强型绿色荧光蛋白（eGFP）-cmRNA，结果表明磁性脂质复合物的效率更高，其产生的荧光增加了1.5倍。
基于mRNA的支架可改善骨骼再生：在组织工程中，当使用支架递送小分子时，负载分子的稳定性和持续释放很重要。最初确认了mRNA在骨组织工程中的优越潜力后，有必要确定如何准备稳定且可持续的支架来递送mRNA。应该设计支架参数（例如生物相容性，生物降解性，化学组成，内部结构，孔径和机械性能）以促进骨骼重塑过程。基因转移有两种主要方法用于组织再生。间充质干细胞（MSCs）在体外用核苷酸分子转染，然后移植到缺损部位。成骨基因修饰的支架直接移植到缺损部位，以在体内募集MSC。但是，后一种方法更常用于基于mRNA的骨再生治疗（表1）。本节描述了两个典型的基于mRNA的支架（纤维蛋白凝胶支架和胶原蛋白支架），并讨论了一些化学外成分，例如磷酸钙，可以添加到支架中以增强骨骼的形成。
除羟基磷灰石（HA）外，胶原蛋白占骨组织的大部分，并且具有复杂的结构。天然胶原蛋白以两种形式出现：呈水肿状或呈格子状组织的稀疏纤维。作为原料的I型胶原蛋白是最常用于制造支架的类型。对于不承重的骨缺损，例如颅骨缺损，由于其有限的机械性能，可以使用胶原蛋白样支架来模拟原始骨组织的组成。 Badieyan等设计的真空干燥胶原蛋白海绵支架预先装有cmRNA和脂质的复合物，可以通过弱相互作用与支架结合，以确保延长和持续释放以进行有效的转染。在他们的研究中，真空干燥后，胶原海绵支架具有封闭的结构，包裹了cmRNA /脂质。随后，在胶原海绵支架逐渐降解期间，从支架释放RNA复合物。研究结果表明，该支架可以提供11天的稳态蛋白质生产。另外，Zhang等在类似的情况下延长了体内修复时间，这对大鼠的关键尺寸股骨缺损产生了改善性修复效果，为期8周。PLGA微粒迅速降解以允许细胞向内生长。同时，降解的增强产生了cmRNA复合物的稳定释放。Balmayor等比较了纤维蛋白凝胶和微宏双相磷酸钙（MBCP）颗粒在3D培养环境中加载hBMP-2 cmRNA后的分子释放速率。首先，与2D培养物相比，3D纤维蛋白凝胶和MBCP颗粒产生了优异的基因表达。其次，MBCP在cmRNA的快速释放和基因转染效率降低中起作用，而血纤蛋白凝胶产生的细胞内化作用增强。尽管这些材料是为临床上使用的材料开发的，但仍应对材料进行进一步的修饰以良好地递送mRNA。
表1 用于骨骼愈合的基于mRNA的支架列表
图1 通过基于miRNA支架的疗法进行miRNA调控的成骨分化的示意图
表2 用于骨骼愈合的基于miRNA的支架列表
图2 用于骨骼再生的基于RNA的支架的示意图。
表3 用于骨骼修复的基于siRNA的支架列表
讨论
最近，由于RNA的特殊优势，基于RNA的治疗方法引起了人们对用于治疗多种疾病的强烈兴趣。在这篇综述中讨论并总结了用于骨骼再生的基于RNA的支架，强调了使用RNA来促进成骨性，作为治疗性分子加载到支架上/之中。在设计用于保护和递送RNA的各种生物材料中，LNP和聚合物NP是用于携带RNA的主要载体，水凝胶和胶原蛋白是最常见的用于将RNA复合物递送至体内骨骼位置的支架材料。但是，在骨骼再生中使用基于RNA的疗法仍处于起步阶段，应进一步满足临床需求。首先，骨骼修复是一个漫长而复杂的过程。各种伤害或不同程度的损害可能导致临床上不同的愈合效果，这将给成功利用基于RNA的疗法带来更多挑战。此外，在基于支架的骨骼治疗过程中，物理环境（机械性能、粗糙度、组分浓度以及支架的宏观形状）和化学因素（例如环境pH）的影响对于骨骼重塑过程也很重要。其次，RNA可以在体外稳定释放超过50天，通过单细胞系测试的RNA递送系统可在体外使用，但在体内并不容易。此外，RNA的长期持续释放并不等同于RNA的长期转染。因此，延长体内有效时间仍然值得探索。最后，尽管已经探索了许多用于治疗骨损伤的RNA输送支架，但尚未建立低成本，广泛而有效的基于RNA的支架的制备方法。为了促进商品化支架的开发，可能会引入3D打印技术来制造基于RNA的支架。此外，可以考虑使用某些纳米载体以成功治愈骨缺损。
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