综述 | Molecular Cancer：环状RNA在人类癌症中的翻译及其功能作用（国人作品）
编译：嗯，编辑：十九、江舜尧。
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本文主要对环状RNA翻译起始的可能机制和翻译能力的复杂性进行综述，并总结了环状RNA编码蛋白在人类癌症中的新功能。环状RNA由共价闭合环反剪接形成，是一种环形非编码RNA。在环状RNA中，下游的剪接供体位点可以共价连接到上游的剪接受体位点。第一个环状RNA是1976年在RNA病毒中发现的，此后，环状RNA则一直被研究者认为是由异常剪接导致的偶然事件。调节因子调节靶基因表达以及与RNA结合蛋白结合并发挥相应转录调控功能。近年研究表明，一些胞质环状RNA可被翻译成可检测的多肽，这提示了环状RNA在细胞生理功能中的重要性。内部核糖体进入位点（IRES）与N6-甲基腺苷（m6A）促进了人细胞中环状RNA的蛋白翻译的有效启动，被认为是环状RNA翻译的潜在启动机制。环状RNA已被证明是一类丰富而保守的RNA分子，并以组织特异性、细胞类型特异性以及物种不同生长发育阶段特异性的方式广泛表达。最新研究证实了环状RNA生物学功能，尤其证实了环状RNA在肿瘤中会发挥重要调控作用。环状RNA可以作为转录因子调控宿主基因的表达。也可以作为miRNA海绵对miRNA-RNA轴进行调控。有研究表明，环状RNA有性质稳定，也可以作为预后的生物标志物。此外，部分研究工作已经证明了环状RNA能够编码小分子肽，这将在很大程度上拓宽我们对细胞生理功能的理解。
论文ID
原名：Translationand functional roles of circular RNAs in human cancer.
译名：环状RNA在人类癌症中的翻译和功能作用
期刊：MolecularCancer
IF：10.679
发表时间：2020.2.15
通讯作者：Lei M, Zheng G,
通讯作者单位：江苏徐州医科大学癌症研究所
DOI号：https://doi.org/10.1186/s12943-020-1135-7
主要内容
1 环状RNA的属性与特征
环状RNA由前体mRNA通过经典可变剪切加工产生，是一类由3'端反向与5'端连接形成的共价闭合环状RNA分子。根据环状RNA包含的序列类型，可以将环状RNA分为3类：外显子环状RNA (EcRNA)、内含子环状RNA (CiRNA)和外显子-内含子环状RNA(EIcRNA)。已有文献报道，一些内含子环状RNA被隔离在细胞核中，而外显子环状RNA则被输出到细胞质中。目前发现的环状RNA以外显子环状RNA为主，可广泛存在于胞浆中。
环状RNA的结构缺少5’-帽结构和3’末端结构，这使得它们对核糖核酸酶(如RNase R)的消化产生了抗性，并具有比线性RNA长10倍的半衰期。大部分环状RNA序列高度保守。最近的研究表明，大约15000个人类环状RNA序列可以在小鼠或大鼠基因组中检测到。环状RNA通常在绝大多数人体组织中表达，尤其在人脑中高表达。此外，环状RNA的表达总是以组织或细胞特异性的方式进行，这使得它们成为人类癌症生物标志物研究的合适候选基因。
2 环状RNA的全基因组分析
通过对总RNA中的核糖体RNA(rRNA)清除后建库并分析挖掘新的环状RNA，利用该方法可以同时提供编码RNA和非编码RNA的表达谱数据信息。此外，对环状RNA的定量分析需要相当大的测序深度，以确保可以正确识别环状RNA。Salzman等人使用核糖体RNA缺失的转录组测序法鉴定了人类肿瘤细胞中存在的scrambled-exon以及潜在环状RNA。在最近的一项研究中，Memczak等人系统地探索了环状RNA在人类、小鼠和线虫中的表达，发现环状RNA的表达有高度组织特异性，同时，环状RNA在同一生物的不同发育阶段也具有高度表达特异性。随后，在测序前研究者们采用全基因组RNA外切酶富集策略，这种方法可以对样品中环状RNA分子进行富集，从而可以鉴定出更多的环状RNA。最近的一项研究使用外显子组捕获测序对＞2000个癌症样本中的环状RNA进行了检测和定量分析，并获得了大量富集的环状RNA。
不断发展的生物信息学为识别新的环状RNA提供了新方法，这些方法主要是对基于反向剪接原则对基因序列进行跨域读取（backsplice junction-spanningsequencing reads），首先，那些连续排列的基因组和/或转录组的序列被算法过滤筛除，从而使unaligned reads以反向剪接（backsplice）的方式进行连接，但这种算法可能会引起排序与匹配错误，并导致数据的“假阳性”。开发这些算法是为了避免reads counts，样本数，抗-RNase R（RNase R resistance）的干扰导致的数据“假阳性”。但如果研究者采用多种环状RNA生物信息学预测算法进行组合分析，则可很大程度上减少“误报”。
3 环状RNA的功能
以帽子不依赖方式翻译蛋白：环状RNA可分为三种不同类型:外显子环状RNA (EcRNA)、内含子环状RNA (CiRNA和外显子-内含子环状RNA (EIcRNA)。CiRNA和EIcRNAs可能被隔离在细胞核中，而EcRNAs则主要输出到细胞质中。既往研究认为，5′与3′非翻译区（UTR）是真核生物细胞的蛋白质翻译必要条件，由于缺乏5’-帽结构与3’-末端，环状RNA一度被认为是非编码RNA，但近年研究表明，在真核细胞中，IRES-和m6a介导的翻译起始都是环状RNA翻译的重要机制。内部核糖体进入位点（IRES）与N6-甲基腺苷（m6A）促进了人细胞中环状RNA的蛋白翻译的有效启动，被认为是环状RNA翻译的潜在启动机制。目前还不知道真核生物中是否有其他翻译机制。
大量研究证明环状RNA可与多核糖体结合，其中包括蛋白翻译的起始密码子AUG以及开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),这意味着环状RNA或许有蛋白质翻译功能。在一项研究中， Sarnow等人发现，人工构建的环状RNA可招募40s核糖体亚基，并在体外启动可检测肽的翻译。然而，本实验并不支持环状RNA在体内也可以作为翻译分子的观点。2015年，Abe等人证明了内源性环状RNA作为翻译模板。含有无限开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)的环状RNA可以通过滚动循环进行高效翻译，从而产生大型蛋白聚合体。2017年, Legnini 等人报道了Circ-ZNF609，这是由ZNF609外显子反剪接形成的环状RNA，它能以剪接依赖和帽子不依赖的方式翻译蛋白。
到目前为止，只有少部分的环状RNA的生物学意义得到了研究，大部分环状RNA被认为是细胞质中的miRNA海绵。最具代表性的环状RNA是ciRS-7，它包含了70多个miR-7保守结合位点。此外，circHIPK3还可以调节多种miRNA的转录活性。环状RNA的另一个重要功能是充当蛋白海绵，部分环状RNA可与特异性蛋白结合并成为蛋白的“存储库”，诱导并促进细胞对细胞外刺激的快速反应。
1）环状RNA以帽子不依赖方式翻译蛋白（图1）：IRES-和m6a介导的翻译起始都是circRNA翻译的重要机制。真核细胞中环状RNA的蛋白翻译不依赖帽子结构。
2）IRESs介导的翻译：IRESs是位于mRNA 5’端的非编码区序列，可以直接招募核糖体启动翻译。大约10%的人类mRNA分子中包含IRES序列。IRES介导的翻译方式是目前被广泛接受的环状RNA翻译启动机制之一。人工构建的体外合成环状RNA可以被成功翻译, 人工构建的IRES和GFP序列片段可以通过精确的反向剪接连接在一起。 IRES介导的翻译可以使环状RNA生成功能性荧光蛋白（GFP）。但到目前为止，环状RNA中IERS数目仍然未知。最近研究表明，大量的AU-rich 基序列(~ 10 nt)可以具有类IRES功能并启动环状RNA翻译。任何长度大于50 nt环状RNA，则可能包含具IRES类似结构的六聚体片段。IRESs对环状RNA的要求很容易得到满足，这说明了细胞质中环状RNA以帽子不依赖方式进行蛋白翻译的重要性和普遍性。
3）m6A（N6-methyladenosines）修饰后的翻译：环状RNA可以进行m6A甲基化修饰，m6A修饰是RNA中存在的一种碱基化学修饰方式，参与调控了RNA许多重要功能。m6A全称是N6-methyladenosine，是在RNA分子5’端的A碱基第六位的N元素上加上一个甲基基团的修饰方式。已有研究表明，5’端的非编码区（UTR）中的m6A可以直接与真核起始因3 (eIF3)结合，并绕过m7G cap的需求直接募集43S预启动复合物（43S preinitiationcomplex），以帽子不依赖方式进行蛋白翻译。最近一项研究表明，RNA中5’非编码区存在m6A残基，控制核糖体扫描以及后续启动密码子在综合应激反应中的启动。mRNA ATF4的翻译启动由eIF2α信号通路以及m6A修饰后对氨基酸饥饿（amino acidstarvation）产生反应，同时，干扰m6A去甲基化酶和甲基转移酶可以影响ATF4的翻译。因此，5’非编码区中m6A修饰在替代翻译启动过程中起着动态调节的作用。研究发现，其他转录本中5’非编码区的m6A甲基化修饰还可以控制起始密码子的选择，从而进行替代翻译的控制。有报道称，一些含m6A的短RNA元件具有类似于IRES的活性来启动环状RNA翻译。Yang等人的研究表明，短mRNA元件小红含有的大量的m6A元件具有IRES活性，并可以启动环状RNA的翻译。单个的m6A修饰足以启动环状RNA翻译，通过m6A的识别蛋白YTHDF3与环状RNA的修饰位点结合，募集eIF4G2启动翻译。当m6A去甲基化酶FTO被消耗，则可以抑制环状RNA翻译时。同时，敲除m6A甲基转移酶METTL3/14可促进应激条件下环状RNA的翻译。使用RNase R进行预处理，并用高通量测序检测m6A-seq，研究者发现至少13%的环状RNA包含m6A修饰,研究者证明了250个环状RNA与多聚体相关，它们可能具有积极的翻译潜力。
4 用于识别环状RNA编码潜能的生物信息学工具
利用生物信息学方法对具有编码潜力的环状RNA进行系统识别是必要的，并可为环状rna衍生蛋白的功能研究提供思路。本文综述了预测环状RNA编码潜能的生物信息学工具(Table1).
表一
5 环状RNA翻译评价的实验方法
除了利用计算进行估计，研究者更希望可以通过实验验证环状RNA是否确实具有翻译能力，核糖体图谱分析（ Ribosome profiling）与多聚核糖体分馏法（polysomal fractionation）使整体分析成为可能。从这些线索可以推断核糖体的密码子运动。近年来，人们利用核糖体谱对全基因组翻译进行了鉴定。通过核糖体足迹中存在的反向剪接连接进行鉴定，39个基因共产生40个与核糖体结合的环状RNA。通过蔗糖密度梯度离心技术，多聚核糖体分馏法可以直接测定环状RNA在全基因组范围内的翻译效率。这两种方法是互补的，使全基因组的翻译分析成为可能。对于环状RNA编码的潜在多肽，质谱分析是一种广泛应用的多肽检测平台。
6 环状RNA在人类肿瘤中的翻译
到目前为止，已经发现了几种翻译的环状RNA，它们在人类癌症中起着关键作用。环状RNA编码的多肽通过干扰肿瘤代谢或转移发挥抑瘤作用，本研究对其进行详细介绍。已有文献报道，一些环状RNA通过编码多肽可基于RNA的调控机制发挥其生物学功能。部分研究表明，有些环状RNA在人类癌症中具有双向功能，这代表环状RNA的能力仍有待进一步探索（Table 2）。
因此，环状RNA编码的多肽具有成为治疗靶点和肿瘤生物标志物的巨大潜力。鉴于其高度肿瘤特异性，环状RNA编码的多肽将成为抗肿瘤蛋白药物筛选的新靶点。迄今为止，肿瘤生物标志物在早期发现、精确治疗和预测预后方面发挥着重要作用。这些环状RNA编码的多肽有很大的潜力成为有用的肿瘤生物标志物。综上所述，环状RNA编码蛋白的研究将为肿瘤的诊断和治疗提供新的途径。
（1）circLINC-PINT在脑胶质瘤中的翻译
circLINC-PINT来自于LINC-PINT（long intergenic non-coding RNA p53-induced transcript），并编码含有87个氨基酸的肽(PINT87aa)。这个1084 nt环状rna是由外显子2的循环形成的。PINT87aa主要集中在细胞核内，对细胞的增殖和肿瘤的发生具有抑制作用。PINT87aa可与PAF1复合物相互作用，抑制多种致癌基因的转录延伸，同时，PINT87aa作为PAF1复合物的结合伙伴，对PAF1复合物的正确定位起着重要的作用。
（2）circβ-catenin在肝细胞癌中的翻译
Wnt /β-catenin信号通路在肝细胞癌中进行了广泛的研究。GSK3β诱导的β-catenin磷酸化和降解可能导致Wnt通路的激活，这与肝细胞癌发生以及预后不良密切相关。circβ-catenin是CTNNB1基因外显子2 至外显子7通过反向剪接形成的1129nt 环状RNA分子。由CTNNB1基因可以形成24个环状RNA。circβ-catenin是在肝癌细胞中唯一的亚型表达，circβ-catenin可以编码β-catenin-370aa,其主要位于细胞质中。进一步的体外和体内实验表
明circβ-catenin可以通过激活Wnt通路促进肝癌细胞生长。同时，研究者证明，由GSK3β充当“诱饵”,β-catenin-370aa可以使GSK3β诱导的β-catenin 降解失效。
（3）circFBXW7在胶质瘤和乳腺癌中的翻译
circRNA是由肿瘤抑制因子E3连接酶FBXW7产生的，名为circFBXW7。circFBXW7通过FBXW7基因的外显子3至外显子4反剪接形成，其长度为620 nt。circFBXW7编码翻译FBXW7-185aa，FBXW7-185aa被认为是神经胶质瘤的肿瘤抑制因子。它与去泛素化酶USP28竞争性相互作用，拮抗USP28诱导的c-Myc的稳定性。
（4）circPPP1R12A在结肠癌中的翻译
郑等人发现了一种新的circRNA，名为circPPP1R12A，由PPP1R12A基因产生。circPPP1R12A编码73个氨基酸(circPPP1R12A-73aa)。与circSHPRH结构类似，在蛋白质翻译过程中，环状结构包含重叠的起始密码子和终止密码子。circPPP1R12A在肿瘤中表达明显上调，且在结肠癌中表现出抑癌活性。功能分析表明，CircPPP1R12A-73aa可通过激活结肠癌Hippo-YAP信号通路，促进结肠癌的增殖和转移能力。
（5）circAKT3在胶质母细胞瘤中的翻译
最近，Xia等人对一种由AKT3基因产生的环状RNA(circAKT3)进行了鉴定。circAKT3由AKT3基因的第3外显子至第7外显子产生，全长524 nt，编码174个氨基酸新蛋白(AKT3-174aa)。对circAKT3表达的分析表明，AKT3-17aa具有潜在的抑癌活性。AKT3-174aa可与磷酸化的PDK1相互作用，限制AKT3-thr308磷酸化，并对PI3K/AKT信号强度起负调控作用。
（6）SHPRH-146aa在胶质瘤与肝细胞癌中的作用
由SHPRH基因（SNF2 histone linker PHD RING helicase (SHPRH)）产生的新的环状RNA被鉴定出来。成熟的环状SHPRH是由26 ~ 29个外显子反剪接形成的，环状SHPRH的总长度为400个核苷酸。其中，基序UGAUGA包含重叠的起始密码子和终止密码子(起始密码子为AUG，终止密码子为UGA)。circSHPRH是真核细胞中第一个在蛋白翻译过程中具有重叠起始和终止密码子的环状RNA。他编码了一种新型蛋白(SHPRH-146aa)，这个蛋白由146个氨基酸组成，并在肿瘤进程中表现出抑癌活性。进一步研究表明，SHPRH- 146aa可以保护SHPRH蛋白不被泛素蛋白酶体降解。有研究称circSHPRH可以编码SHPRH-146aa并抑制胶质瘤的发生，也可以作为miRNA海绵吸附者抑制肝细胞癌进程，同时，circSHPRH被认为是肝癌的一种生物标志物。因此，我们有理由推测circSHPRH有可能在其他人类肿瘤中也被翻译出来。
（7）circZNF609在乳腺癌与肌肉生成过程中的作用
circZNF609可作为加速乳腺癌进程的miRNA海绵，并可在肌肉生成过程中编码蛋白。
结论
关于环状rna的翻译及其在人类癌症中的功能作用，研究者对此已经有了新的认识。在这篇综述中，我们总结了环状RNA可能作为翻译模板的情况。研究者针对环状RNA的研究，开辟了一个新的研究视角。毫无疑问，在不久的将来会有越来越多新的环状RNA编码蛋白被发现，一个隐藏的人类蛋白质组将启示我们环状RNA在人类生活中的重要性。
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