骨折恢复新机制—Nature:脂质利用度如何决定骨骼祖细胞的命运？

骨修复重复了发育性软骨内成骨过程，由骨膜骨祖细胞启动，最初形成无血管的软骨模板，随后被骨替代。在参与软骨形成的因素中，转录因子 SOX9 的研究最为广泛，但其如何在骨骼祖细胞中被诱导却知之甚少。由于软骨是无血管的，血管本身的缺失被认为启动了软骨生成，但其因果关系尚未得到证实。基于此，2020年2月26日比利时科学家Geert Carmeliet在《Nature》上发文Lipid availability determines fate of skeletal progenitor cells via SOX9。在本研究中，作者们提供的证据表明，在骨愈合过程中，局部血管通过涉及脂质代谢、FOXO 信号和 SOX9 的多方面机制决定了骨祖细胞命运。

图1：在骨愈合过程中阻止血管长入可诱导软骨形成

为研究血管的缺乏是否决定骨骼祖细胞的命运，作者将可存活的（自体）骨移植物移植到小鼠股骨缺损处，诱导骨膜驱动的愈合反应。靠近宿主-移植物边缘的骨膜祖细胞形成软骨，而中心细胞直接分化为骨形成成骨细胞。骨膜细胞没有促进骨痂中的血管，但积极促进血管长入，因为其减少了骨形成和骨痂血管化。在PFD7（PFD，post-fracture day），即骨折后第 7 天，中心骨膜骨痂血管与周围肌肉高度相连，提示骨膜细胞吸引该部位的血管。为了研究这种血管长入对骨修复的重要性，作者在移植物和肌肉之间插入了孔径不同的聚碳酸酯滤器。在 PFD7，插入一个 30um孔过滤器仍然允许毛细血管穿过孔隙，而0.2m孔径可防止血管长入骨膜层，左下图显示肌侧过滤器附近的大量毛细血管。同时，由于增殖减少和细胞死亡中度增加，骨膜细胞减少，但更重要的是，SOX9 早期成软骨细胞的数量在中央移植区域较高。该软骨形成开关导致 PFD14 中心区域的骨较少，但 2 型胶原 (COL2) 软骨基质较多，移植细胞分化为软骨细胞而不是成骨细胞。在 PFD28 时，在两种情况下均观察到成功愈合，尽管带滤器的骨痂中存在小软骨岛表明愈合延迟。因此，当血供有限时，骨祖细胞经历成软骨分化而非成骨分化，确保成功骨愈合。

图2：脂质缺乏诱导骨祖细胞中的 SOX9

为了验证脂质缺乏诱导软骨形成这一假说，作者使用两种骨祖细胞模型研究了细胞 命运的营养控制：C3H10T1/2 细胞系和原代鼠骨膜细胞，前者具有更多的异质性，但含有真正的骨干细胞和祖细胞。作者从新生小鼠总长骨中分离出免疫表型明确的骨骼干细胞，这些干细胞是同质的，但数量有限。联合营养剥夺（CND；血清氧、葡萄糖和谷氨酰胺水平降低）增加了 C3H10T1/2 或骨膜细胞中的 SOX9 蛋白和 mRNA 水平。而成骨、成脂或肌源性转录因子的表达没有变化。正如所报告的那样，剥夺 C3H10T1/2 细胞的个别营养物质表明，低氧水平增加了 SOX9，而降低葡萄糖或谷氨酰胺水平几乎没有影响。出乎意料的是，血清剥夺导致SOX9 mRNA 和蛋白大量快速积累，导致转录和翻译增加。血清剥夺也增加了骨膜细胞中的 SOX9，并增强了其在微团培养中的成软骨分化，但阻止了成骨分化。这种成软骨开关的一个可能的解释是避免细胞死亡。

事实上，敲除 C3H10T1/2 细胞、骨膜细胞和生长板来源的软骨细胞中的 SOX9 降低了 CND 中的细胞活力，在血清剥夺中也有少量降低。因此，骨骼祖细胞通过增加 SOX9 水平和软骨形成来快速适应特定的营养应激。血清是脂质的主要来源，作者质疑血清剥夺诱导的骨祖细胞软骨形成是否归因于脂质剥夺。向 C3H10T1/2 细胞补充油酸、棕榈酸、极低密度脂蛋白或多不饱和脂肪酸 (PUFA)可防止血清剥夺期间 SOX9 增加。此外，降脂血清 (LRS) 也可以模拟血清剥夺的影响。LRS 提高 C3H10T1/2 细胞中 SOX9 水平，促进微团或团块培养中骨膜细胞的成软骨分化，该作用可部分被外源性脂肪酸逆转，并抑制其成骨分化。在所有研究的细胞类型中，脂质剥夺增加了 SOX9高表达的细胞数量。

接下来，作者测试了在更符合生理条件的情况下，脂质是否也能控制骨祖细胞的分化。由于局部去除外源性脂质是不可行的，作者首先使用胚胎跖骨培养，一种器官样离体骨发育模型。血清剥夺增加了 SOX9 软骨细胞的数量并阻止了成骨，表现为 Col1a1 表达细胞的缺失和矿化，并且这个现象可被脂肪酸补充逆转。其次，骨折修复过程中局部注射脂肪酸使骨痂中软骨量减少。第三，游离脂肪酸受体 1 (FFAR1) 和 FFAR4 的激动剂 GW9508 在三种细胞模型中阻止了血清剥夺或 LRS 诱导的 SOX9 增加。因此，在骨折修复过程中局部注射 GW9508 降低了骨痂中的软骨，而不影响编织骨区域。作者的研究结果表明，在存在滤器的情况下植骨愈合过程中的成软骨转换主要是由于不存在与血管化不良相关的外源性脂类。另外，作者还发现脂质在含有骨膜细胞的胶原凝胶中的扩散远低于葡萄糖，表明当血管化不足时，脂质是一种限制性营养物质。总之，血管形成减少引起的脂质剥夺可能是骨愈合过程中骨膜软骨形成的重要决定因素。

图3：SOX9 抑制软骨细胞中的 FAO

当血脂稀少时，为什么软骨形成是有益的。作者假设软骨细胞代谢不依赖于外源性脂质。为了验证这一点，作者比较了软骨细胞与骨骼祖细胞和成熟成骨细胞的代谢特征。据报道，软骨细胞高度糖酵解。成骨细胞的耗氧速率 (OCR) 最高，这不是由于高糖氧化，而是由于脂肪酸氧化速率 (FAO) 较高。软骨细胞表现出低 FAO，骨骼祖细胞具有中间特征。为了证实体内的这些发现，作者检测了小鼠长骨单细胞RNA-seq 数据集的代谢基因标签，该图谱包含 17 种非造血细胞类型，包括骨骼祖细胞、软骨细胞和成骨细胞。与成骨细胞相比，不同软骨细胞群显示 FAO 基因低表达和糖酵解基因高表达。与皮质骨样本相比，生长板软骨中糖酵解基因 Slc2a1（编码 GLUT1）、Pfkfb3 和 Ldha 的表达较高，但 FAO 相关基因 Cpt1a、cadm 和 cadl 的表达较低。免疫组化显示生长板和骨折骨痂软骨细胞中 CPT1a 水平较低，GLUT1 水平较高，而骨小梁成骨细胞 CPT1a 和 GLUT1 水平均较高。静脉注射荧光脂肪酸和葡萄糖类似物显示标记脂肪酸存在于成骨细胞中，但不存在于生长板或骨折骨痂中的软骨细胞中，而标记葡萄糖被两种细胞摄取，证实软骨细胞中的低 FAO 与脂质缺乏相关。CPT1a 的缺失使骨折愈合过程中的骨骼干细胞失去了成骨分化但保留了成为软骨细胞的能力。

饥饿诱导的脂滴生成和分解均与自噬相关，作者证实C3H10T1/2 细胞和骨膜细胞在血清剥夺后早期激活自噬。相应地，C3H10T1/2 细胞在血清剥夺期间脂滴数量最初增加，然后在 6h 下降，敲除必需自噬体蛋白ATG525 阻止了血清剥夺后脂滴的最初增加和晚期分解。此外，溶酶体药物氯喹在暴露后可立即降低 FAO 连接的 OCR的骨膜细胞到血清剥夺和血清剥夺期间 C3H10T1/2 细胞和骨膜细胞的存活率降低。总之，这些数据表明，骨骼祖细胞依赖于溶酶体介导的细胞内脂质储存的动员，以暂时支持 FAO，并在细胞外脂质变得有限时确保存活。脂质剥夺后同时发生 SOX9 水平的增加和总 FAO 的降低，提示它们之间存在联系。骨膜细胞中 SOX9 缺失阻止了血清剥夺对 FAO 的抑制，而使用依托莫昔芬抑制 FAO不会改变 SOX9 水平。而且，敲除生长板来源的软骨细胞中的 SOX9 不仅诱导了典型软骨细胞特征如鹅卵石样形态的丧失和 Col2a1 和 Acan 的表达，还增加了 Cpt1a 和 Acadl 的表达和软骨细胞中 FAO 的比率。相比之下，颅骨成骨细胞中SOX9 的过表达降低了 FAO。因此，SOX9 通过抑制 FAO 在成软骨细胞中作为代谢调节剂。

图4：脂质饥饿时 FOXOs 诱导 SOX9

作者下一步检测脂质如何调节 SOX9 水平。转录组学显示 C3H10T1/2 细胞中 Sox9 表达的稳健上调在血清剥夺后 1h 开始，从 3h 开始增加其他几种软骨形成标记物的表达。差异表达分析显示，随着时间的变化，678 (1h)、4,022 (3h) 和 3,811 (6h) 个基因在血清剥夺后显著上调，包括 Sox9 作为所有时间点的热门点击之一。共有 757 (1h)、2167 (3h) 和 3872 (6h) 个基因显著下调，包括与增殖（Egr3、Dusp5 和 Errfi1）、骨骼干细胞（Nes 和 Itga5）和成骨（Spp1 和 Adam19）相关的基因。

作者证实，血清剥夺增加了C3H10T1/2 细胞的核 FOXO1 和 FOXO3a和 C3H10T1/2 和骨骼干细胞的活性 FOXO 水平，这一作用可被外源性脂肪酸阻止，表明细胞外脂质控制 FOXO 活性。更具体地说，FOXO1 和 FOXO3a 在血清剥夺过程中与 Sox9 启动子的结合增加，FOXO 抑制剂 AS1842856 在所有细胞类型中阻止了脂质剥夺过程中对 Sox9 的诱导。利用 CRISPR-Cas9 方法有条件地删除 C3H10T1/2 细胞中的 Foxo1 和 Foxo3a（又称 Foxo3），或利用骨骼干细胞中的短发夹 RNA (shRNA)采用RNAi手段也 获得了类似的结果。

这些数据表明，FOXOs 直接控制 Sox9 在脂质剥夺中的转录。作者接下来证实了在骨愈合过程中脂质剥夺，FOXOs 和 SOX9 之间的关系。骨-移植物愈合过程中，过滤器 (0.2um)的存在增加了中心骨膜区域中核 FOXO3a 阳性细胞的数量，与 SOX9 细胞的增加相似。在骨折愈合过程中，使用 FFAR1/4 激动剂 GW9508 刺激脂肪酸信号，可显著减少骨膜骨痂中 FOXO3a 细胞核的数量，与软骨数量减少相关。FOXO1 和 FOXO3 失活的骨骼干细胞不能植入胫骨骨折，这可能是由于它们不能增加脂质剥夺的 SOX9 水平。骨折愈合过程中每日局部注射 FOXO抑制剂 AS1842856 可减少软骨量，同时不影响新骨形成。因此，FOXO 信号缺乏受脂质利用度的负调节，在骨愈合过程中，FOXO 信号对骨骼祖细胞软骨形成和存活是必需的。

同时作者的发现也让我们相信，局部的营养水平可以通过直接转录变化决定干细胞谱系的选择。因此，成熟细胞的代谢特征可能反映微环境限制以及特定的细胞需求。这可能为其他研究提供较为明确的思路。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2050-1

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