玩转NGS实验室 | 第八期：肺癌8基因检测全流程
高通量测序 (Next Generation Sequencing，NGS) 技术因其通量、成本和效率等各方面的优势，在肿瘤、遗传病及病原微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。随着相关临床研究的持续深入，政策法规的引导与完善，进一步推动了该技术在院内本地化的应用。“玩转NGS实验室”专栏旨在从多角度探讨NGS技术院内本地化应用的相关规范、应用项目及重要进展，推动NGS技术的临床转化。
泛生子以基因测序仪GENETRON S5（国械注准20193220820）为平台，以扩增子建库技术为基础，开发出用于肺癌伴随诊断的诊断试剂盒“人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）（国械注准20203400072）（以下简称“肺癌8基因试剂盒”）”，并获国家药品监督管理局（NMPA）批准上市。本文我们将详细的介绍从我们收取到肺癌组织样本后再进行高通量测序的全流程。
肺癌组织样本的基因检测主要流程包括：肺癌组织样本核酸提取、文库的构建及文库测序（文库扩增、基因测序、数据分析）。[1]
图1 基于NGS技术检测基因突变流程[2]
肺癌组织样本核酸提取
实体肿瘤可用于NGS检测的样本类型主要分为组织、血浆和各种恶性渗出液。
组织样本是检测的重要类型, 主要包含了石蜡包埋组织和新鲜组织两大类。泛生子的肺癌8基因试剂盒用于定性检测为非小细胞肺癌（NSCLC）病人肿瘤组织的样本中的DNA与RNA。在核酸提取过程中，泛生子依托离心柱法对样本中的DNA及RNA进行高效、快速地提取。
肺癌组织样本文库构建
与传统Sanger测序法读长较长但通量较低特点不同，新一代NGS技术是将基因组DNA直接进行片段化或直接用引物扩增目的片段形成短DNA分子，再将短片段化的DNA连接上通用接头。随后经过扩增、纯化后得到完整测序文库[3]。
为满足临床需求，泛生子独创了一步法扩增建库技术（中国发明专利ZL201710218529.4)（以下简称“一步法”），代替了冗长的建库流程，整合实现一管试剂中的“一步”化学反应。
图2 泛生子“一步法”技术、扩增子技术与杂交捕获技术的对比示意图
图3 人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）
（国械注准20203400072）
肺癌8基因试剂盒采用多重PCR（扩增子）的方法，特异性扩增与NSCLC密切相关的基因上热点突变区域，通过“一步法”技术 —— 一次PCR反应，即可构建好用于上机测序的完整文库。整体建库过程人工操作只需 15 分钟人工操作，建库周期缩短至 1.5 小时，非常适合医院独立开展检测实验。
肺癌组织样本文库测序
1
文库扩增
通过油包水的结构，将带有测序引物的微珠与构建好的文库均匀分布到每个油包水结构中形成单分子反应结构，在油包水的结构中通过PCR反应将单个文库扩增2-3个数量级，变成带有大量单克隆文库的可测序微珠。[3]
泛生子文库扩增过程采用全自动加样系统GENETRON Chef（渝械注准20192220364），仅需 15分钟人工操作，GENETRON Chef 将自动过夜完成文库的扩增及芯片加载流程，全程无需人工值守。
图4 全自动加样系统GENETRON Chef
（渝械注准20192220364）
2
基因测序
基因测序即通过采用测序技术，达到检测目的核酸碱基排列顺序的目的。
GENETRON S5是采用半导体测序原理的测序仪，搭配即插即用的模块化试剂，仅需15分钟手动操作完成测序参数设置，并可在2.5小时内自动完成测序。
图5 基因测序仪GENETRON S5
（国械注准20193220820）
3
数据分析
下机数据通过与人类基因组或预设的对照基因组进行对比、过滤、排序、分析等流程，得到核酸的变异类型。
GENETRON S5内置汉化版分析软件，测序完成后即可自动进行数据过滤与分析。同时仪器搭载自动化报告生成软件，一键生成临床指导报告。
检测内容更多、样本需求更少、操作步骤更简洁、样本检测量更灵活、报告周期可缩短至2个自然日，人类8基因突变联合检测试剂盒（半导体测序法）搭配基因测序仪GENETRON S5全面助力肺癌院内本地化检测！
参考文献
[1] 朱耀. 中国前列腺癌患者基因检测专家共识(2018年版)[J]. 中国癌症杂志, 2018, 28(08):72-78.
[2] 《基于下一代测序技术的BRCA基因检测流程中国专家共识》编写组. 基于下一代测序技术的BRCA基因检测流程中国专家共识[J]. 中华病理学杂志, 2018, 047(006):401-406.
[3] 李金明.高通量测序技术[M].北京:科学出版社,2018.
泛生子（纳斯达克代码：GTH）是全球前沿的癌症精准医疗公司，专注癌症基因组学的研究和应用，提供癌症早期筛查、用药指导、预后监测、肿瘤新药研发服务等覆盖癌症全周期的产品与服务，致力于将创新基因组学技术，应用于与癌症相关的诊断、治疗，最终战胜癌症。