Developmental Cell：衰老中，皮下脂肪为什么会减少？

 背景介绍

在整个生命周期中，脂肪组织的质量和脂肪成脂分化潜力都会发生变化。脂肪组织的血管基质成分（Stromal vascular fraction，SVF）中存在一类细胞，名为前脂肪细胞（Adipose precursor cells），它能分化成脂肪细胞，从而增加脂肪细胞数量。在传统方法中使用脂肪祖细胞（Adipose progenitor cells，APCs）特定的分子标记物，如CD24、Pdgfra和Pref-1（也称为Dlk1），通过流式细胞荧光分选（FACS）和遗传谱系示踪（Genetic lineage tracing）方法进行特定分离鉴定，进而揭示出脂肪组织中存在的细胞异质性。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经成为解析前脂肪细胞（adipose precursors）异质性的一项新技术，它为从多能间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）到确定命运的前脂肪细胞（Committed adipose precursor cell）的分化成脂轨迹提供了新的见解。然而，许多scRNA-seq研究使用了FACS去除免疫细胞后的SVF细胞，因此它们可能反映不了所有的前脂肪细胞（adipose precursors）亚群，从而无法说明这些细胞的完整结构层次。

在衰老过程中，内脏脂肪组织（Visceral adipose tissue，VAT）和肌肉间脂肪（Inter-muscular fat）呈现增加的趋势。相比之下，小鼠和人类的外周皮下脂肪组织（Subcutaneous adipose tissue，SAT）随着年龄的增长而显著减少。VAT与如胰岛素抵抗和心血管疾病等在内的病理状态的发生发展有关，而SAT含较多米色脂肪，可以促进产热能力增加，对人类代谢性疾病则具有潜在的保护作用。尽管VAT和SAT在衰老过程中的发生不同的变化，但是一般认为它们作为人类脂肪祖细胞（adipose progenitors）的增殖和分化能力都会在衰老过程中会急剧下降。由于这些细胞会发生衰老和凋亡，最终导致小鼠和人类的白色脂肪（White adipose tissue, WAT）质量改变，并对全身代谢产生影响。然而，至今为止在衰老过程中SVF细胞亚群的潜在变化以及不同亚群之间存在的相互关系、分子机制研究尚不清楚。

为了研究SAT在衰老过程中减少的分子机制，研究人员使用了scRNA-seq方法比较了年轻和衰老小鼠SAT中未去掉免疫细胞的全部SVF细胞。作者发现，随着年龄的增长，前脂肪细胞亚群（Adipose precursor populations）的数量急剧下降，同时检测到SAT中出现一个细胞亚群，此细胞亚群伴随衰老而产生并进一步积累，研究人员将其命名为小鼠的衰老依赖性调节细胞（Aging-dependent regulatory cells，ARCs）。在老年志愿者的SAT中检测到了ARC亚群，而年轻志愿者中则没有发现。虽然ARC细胞亚群也有表达脂肪祖细胞（adipose progenitor）阳性标记分子物，但它们表现出分化能力受损，并高表达炎症细胞因子，如Ccl6。除此之外，该细胞亚群虽不表达泛免疫标记物分子（pan-immune marker）CD45，但高表达促炎症基因。研究人员还发现，ARC失去增殖和分化为脂肪细胞的能力，并可以通过分泌细胞因子抑制前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化能力。Pu.1（又称Spi1）参与了SAT中ARC的发育，体内前脂肪细胞（adipose precursors）中过表达Pu.1可抑制邻近细胞的分化能力。综上，衰老相关的ARC亚群在衰老过程中出现的前脂肪细胞（adipose precursors）数量减少、脂肪生成抑制和SAT损失中发挥关键作用。

敲黑板啦！

1、ARC只出现在衰老过程中的皮下脂肪

2、ARCs分泌促炎性趋化因子，并抑制脂肪生成

3、ARCs抑制邻近前脂肪细胞（Adipogenic precursors）的分化和增殖

4、Pu.1是ARCs细胞发育和表型功能的关键驱动因子

 研究结果

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 小鼠SAT中ARCs细胞亚群在衰老中出现

研究人员为了探究10周龄（young）、48周龄（aged）和72周龄（old）的三组小鼠的腹股沟WAT（Inguinal WAT，iWAT）中SVF细胞亚群的异质性，采用了scRNA-seq测序方法进行分析。实验过程中为了防止细胞分选过程中产生的潜在偏差，研究人员在不去除Lin⁺细胞（CD45⁺、CD31⁺和Ter119⁺，即不去除免疫细胞和内皮细胞）的情况下使用iWAT的总SVF细胞。对每组2只小鼠的iWAT进行scRNA-seq。分析时，利用Partek Flow生成t分布随机邻近嵌入（t-SNE）图。基因表达谱的无监督聚类分析（Unsupervised clustering），表明在年轻小鼠中存在10个细胞簇，而在衰老小鼠中存在11个细胞簇，每个细胞簇均包含500到2500个细胞左右，每个细胞测序得到平均约19万reads（Fig 1A）。并且研究人员还重复了三次scRNA-seq以确保分类的可重复性（Fig S1A）。值得注意的是，这种无偏差的scRNA-seq能够展现出更全面的iWAT细胞中的不同亚群。且研究人员整合Lin⁺和Lin^-亚群获得的整体祖细胞与常规的去除Lin⁺细胞亚群后进行的测序分析相比，可以更准确的反映iWAT中SVF整体状况。

研究人员通过Fcgr3、Cd79b和Ccl5等免疫细胞标记物确定了Lin⁺细胞亚群，其包括B细胞、T细胞、巨噬细胞和内皮细胞。脂肪组织中的Lin^-细胞亚群含有CD34标记的脂肪祖细胞（adipose progenitor）。在脂肪谱系亚群（adipose lineage populations）中，除了先前发现的3个脂肪祖细胞亚群（MSC、APC和CD142^high APC），研究人员还检测到另外3种细胞亚群：脂肪特异性的成脂Fmod⁺成纤维细胞（AFFs，能分化为脂肪细胞）（Fig S1D）、前脂肪细胞（Preadipocytes）和早期脂肪细胞（Early adipocytes）。研究人员没有在VAT中检测到AFFs（数据未展示），因此其仅存在于SAT中。总之，新检测到的这些前体细胞亚群（precursor populations）可能是由于使用了没有去除Lin⁺细胞亚群的总SVF。此前针对Lin-亚群的SVF研究（直接排除Lin⁺细胞亚群）可能会降低细胞亚群内的异质性：即可能会遗漏除了之前已知的特异性标记细胞类群（Fig S1B）。研究人员还发现了新的更特异的脂肪细胞标记物：MSCs和APCs上的Pi15和CD121a、MSCs特异的Gpr1、APCs的Pref-1，CD142^high APCs的Ramp1和Aox3，AFFs的Fgf1和Fmod（Fig S1C）。

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特异的脂肪细胞标志物

衰老小鼠iWAT中SVF细胞图谱的最显著的特征是出现了一个ARC的细胞亚群。在48周龄小鼠的iWAT SVF中，该细胞亚群才被检测到，并且其比例在72周龄的小鼠中进一步提高（Fig 1A、2A）。这些ARC也表达脂肪祖细胞（adipose progenitor cells）中表达的CD34⁺、Pdgfrα⁺和Pref-1⁺标记基因。此外，它们表达非常低的内皮细胞标记物CD31和泛免疫细胞标记物CD45，所以它们并不是内皮细胞或免疫细胞。但是，这些细胞高表达炎症标志物基因，如CD163、F4/80（Adgre1）、Lgal3、CD36和NFkB1。它们也表达了高水平的趋化因子，如Ccl6和Ccl8（Fig 1B）。这些趋化因子的表达水平在72周龄的小鼠中进一步提高（Fig 2A）。由于小鼠的体重随着衰老而增加，于是研究人员测试了高脂饮食喂养的年轻小鼠是否会形成ARCs。然而，他们并没有检测到该细胞亚群，这进一步证实了ARC的出现的确依赖于衰老而非单纯的肥胖（Fig S2C）。研究人员接下来探究了ARC的潜在来源及与其他成脂细胞亚群的关系。他们进行了生物信息学（in silico）细胞轨迹拟时序分析。结果表明，CD142^high APC亚群和APC亚群均来源于MSC亚群。研究还发现APCs可以产生前脂肪细胞（preadipocytes）和AFFs，这两种细胞均可向早期脂肪细胞分化。重要的是，ARC被推测是来源于APCs，而不是CD142^high APC，且文中预测它们并无成脂分化潜能（Fig 1E、S1E）。为了进一步验证ARC不是来自于免疫细胞，研究人员用脂肪细胞和免疫细胞进行了细胞轨迹拟时序分析，分析表明，免疫细胞均高表达CD45标记物，而ARC并未高表达CD45。尽管免疫细胞与脂肪细胞没有共同的谱系来源，细胞轨迹分析进一步表明ARC不是来自巨噬细胞或其他免疫细胞（Fig S1F）。

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CD142^high APC

白色脂肪组织（WAT）是一种细胞异质性内分泌器官，不仅作为能量储备，而且积极参与代谢稳态。脂肪组织的主要成分是脂肪细胞，来源于脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）。众所周知，这些ASPC位于脂肪组织的血管基质组分（SVF）中，但它们的分子异质性和功能多样性仍然值得探索。ASPCs是异质性的，至少包括三个亚群：脂肪干细胞（ASCs）、前脂肪细胞（Preadicytes，PreAs）和脂肪形成调节细胞（Aregs）。ASCs（DPP4⁺，CD55⁺）可以产生PreAs（ICAM1⁺，VAP-1⁺）和Aregs（CD142⁺）。

2018年的一篇Nature就曾报道CD142⁺细胞群作为脂肪形成调节细胞以旁分泌的机制抑制脂肪生成。在下图可以明显看出相较于CD142^- ASPCs，CD142⁺ ASPCs的脂质形成量明显下降了。

而CD142⁺细胞亚群对脂肪细胞形成的抑制作用在小鼠和人当中都曾被报道，尽管二者的机制差异还未被完全探明。

本篇文章中的ARC被报道分泌趋化因子来抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化，其功能与CD142⁺细胞类似。这会导致的疑问是ARC亚群是否是来自于CD142⁺的细胞亚群呢？答案是否定的，文中的拟时序分析（Silico cell trajectory analyses）显示ARC亚群来自于CD142^-的APC细胞亚群，其成脂分化能力较低，而且ARC虽然高表达一些趋化因子但是并不表达免疫细胞的泛标记基因CD45，所以ARC并不是属于免疫细胞的亚群。因此，尽管ARC亚群有着和CD142⁺亚群类似的抑制脂肪分化的功能，但二者并不是相互包含的关系，ARC亚群是一个伴随着衰老过程出现的以前从未被报道过的全新亚群。

参考文献：

[1] Schwalie PC, et al. Nature.2018;559(7712):103-108.

[2] Ferrero R, et al. Trends Cell Biol. 2020;30(12):937-950.

接着，作者将ARC细胞亚群与前脂肪细胞（Preadipocytes）的基因表达进行分析比较。结果显示，包括先天免疫应答基因：如Jchain和C1qC（补体C1Q C链）；细胞因子的形成基因：如CD209和Tmf1（TATA元件调控因子1）；T细胞活化基因：如CD151和Ccl5；细胞因子：如TGF-β1、Ccl2和Ccl6，这些基因都在48周龄小鼠的ARC中明显高表达。该细胞亚群的促成脂分化因子：如Dusp10表达极低；而抑制成脂分化因子：Id3、KIf2和KIf7表达水平较高，上述结果表明ARC细胞亚群可能缺乏脂肪分化能力。有趣的是，不同于前脂肪细胞（preadipocytes），这些细胞的粘附分子Col4a3、Col4a4和Col5a2表达水平极低（Fig 1C）。此外，在72周龄小鼠中，ARC中抑制成脂因子和炎症标志物基因表达进一步显著增加，表明随着衰老的发展，ARC的促炎效应和脂肪分化能力受损逐渐被放大（Fig 1D）。且与48周龄小鼠的ARC相比，72周龄小鼠的ARC显示出免疫激活和血管生成相关基因进一步升高（Fig 1C）。总之，这些结果都表明SAT中ARC的出现和积累与衰老有关。

Fig 1 | 小鼠皮下脂肪组织中的ARC在衰老出现

Fig S1 | 单细胞RNA-seq分析揭示了皮下脂肪组织中的不同细胞的亚群

2

通过Lgals3和CD36基因分离出ARC细胞亚群及验证其成脂分化功能降低

为了从SVF中分离和鉴定ARC，研究人员鉴定了两种ARC中高表达的细胞表面蛋白Lgals3和CD36作为分子标记基因（Fig 2B）。研究人员首先利用CD45、CD31和Ter119将iWAT的SVF分为Lin⁺和Lin^-亚群。在Lin^-细胞中，研究人员定义Lgals3⁺ CD36⁺细胞为ARCs。[小编注：与作者之前发现ARC的策略不同，作者从所有的SVF中发现了ARC，并进一步证明不是免疫细胞（CD45⁺CD31⁺），所以后面作者的策略是去掉免疫细胞（CD45⁺CD31⁺），再进一步利用表面marker进行流式分选鉴定出ARC]。流式细胞分析表明Lgals3⁺ CD36⁺细胞大约占Lin^-亚群的33%，这与scRNA-seq数据而估算的细胞比例类似（Fig 2C）。为了探究SAT在衰老中相关的变化，研究人员使用Fabp4对Lin^-亚群的脂肪细胞进行分类。与预期结果一致，48周龄小鼠的SAT中早期脂肪细胞的百分比（3%）显著低于10周龄小鼠（10%）。72周龄小鼠的脂肪细胞百分比进一步下降（0.8%）（Fig2A）。作者也比较了年轻（20周龄）和老年（72周龄）小鼠的SAT重量。结果显示，老年小鼠的SAT质量下降了约50%，而VAT质量和总体重随着衰老而增加（Fig S2A）。这些结果说明衰老过程中，新形成的皮下脂肪细胞减少导致小鼠衰老过程中SAT减少。

接下来，研究人员为了探究ARC的特性，通过qRT-PCR检测了FACS分离的ARC的基因表达。结果显示Lgal3和CD36的水平比Lin^-细胞高出约5倍，同时ARC也高表达脂肪祖细胞 (adipose progenitor)标记物，如CD34、Pdgfrα和Pref-1。与Lin⁺亚群相比，ARC不表达泛免疫标记物CD45或内皮细胞标记物CD31（Fig 2D）。作者进一步检测发现，免疫相关基因，如Jchain、Ptafr、Adgre1（F4/80）的表达水平分别提高了5倍、60倍和40倍；而成脂分化标志基因，如Loxl2和C/ebpβ的表达下降。之前的研究表明TGF-β1可以抑制APCs和前脂肪细胞（preadipocytes）的分化，而ARCs中TGF-β1的表达量增加了5倍，同时趋化因子的表达量显著增加，如Ccl5、Ccl6和Ccl9，分别增加了6倍、35倍和40倍（Fig 2E）。ARCs高表达调节淋巴细胞分化的转录因子，如Bax、Mafb、和Pu.1，也分别增加4倍，6倍和80倍（Fig 2F）。为了验证ARC是否是一个不同的细胞亚群，研究人员将FACS分选后的ARC与APC和CD142-High-APC进行了比较。通过qRT-PCR，研究人员发现在ARC中，ARC特异性高表达Pu.1、Ccl6和TGF-β，这些基因的表达水平显著高于APC或CD142-High-APC（Fig S2E）。整体基因表达谱结果说明ARCs表现促炎特征，并且抑制成脂基因的表达。

下一步，研究人员检测了ARCs细胞亚群的体外分化能力。FACS分选以后，他们进行ARCs培养，发现细胞并不能贴壁生长。进一步qRT-PCR分析显示，与CD38分选后的前脂肪细胞（preadipocytes）相比，细胞粘附因子，如Col5a2、Col14a1、Col1a1、Col1a2和Col3a1的表达量显著降低，而转录因子Fli1（可以抑制成纤维细胞胶原合成）的表达升高大约3倍（Fig 2G）。接下来研究人员在胶原涂层板上培养ARCs来使其贴壁，对ARC和前脂肪细胞（preadipocytes）进行脂肪细胞分化实验。在分化的第0天，基因分析显示ARCs的C/ebpδ、Pparγ和Fabp4表达水平显著降低，而Pref-1表达水平显著升高，上述结果表明ARC可能具有较低的分化能力。油红染色显示，与前脂肪细胞（preadipocytes）相比，ARCs中脂质积累更低。qRT-PCR结果显示Sox9（Sox9是一种已知的抑制脂肪细胞分化的转录因子）的表达增加了2.5倍。并且C/ebpδ、Pparγ和Fabp4等成脂分化因子基因的表达降低2倍（Fig 2H），上述结果表明ARC分化成脂肪细胞的能力受损。当ARCs在较低密度下培养时，它们的增殖能力比前脂肪细胞（preadipocytes）高2倍（Fig 2I）。总结而言，研究人员发现ARCs表达脂肪祖细胞（adipose progenitors）标记物，但它们抑制成脂分化。

接着，研究人员从年轻、老年和高脂喂养的年轻小鼠的SVF中分离ARC并进行比较。FACS分析显示，虽然在年轻小鼠SVF中几乎检测不到ARC，但在老年小鼠中的比例明显提高（Fig 2J，左）。此外，年轻小鼠高脂喂养并不会诱导出现ARC亚群（Fig S2C）。用ARC标记物Lgals3和CD36对iWAT进行组织染色，染色结果显示老年小鼠iWAT中存在ARC，而年轻小鼠iWAT中不存在ARC（Fig S2D）。为了进一步研究小鼠衰老过程中检测到的ARC亚群是否也存在于人类中，作者将不同年龄健康的捐赠人群的SAT分离出SVF，随后进行流式分选。结果显示在老年人的SAT样本中检测到ARCs（Fig 2J，右）。与小鼠结果相似，研究人员发现随着年龄的增长ARC数量也在逐渐增加，与年轻个体相比，中老年人群中的ARC数量更多。qRT-PCR显示人ARC中LGALS3、CD36和PU.1水平显著高于APCs，并在老年人中表达升高（Fig 2K）。上述结果都表明ARCs确实存在于衰老小鼠和人类的SAT中，并且ARC的存在与年龄相关。

Fig 2 | 通过Lgal3和CD36 分选的成脂能力受损的ARC亚群

Fig S2 | 衰老过程中皮下脂肪组织中出现的以Lgal3和CD36为标记的ARC亚群

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 ARC分泌趋化因子来抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化

由于ARC具有高免疫特性并分泌多种细胞因子，因此它可能潜在地影响邻近的前脂肪细胞（adipose precursors）。于是研究人员通过共培养实验，检测了ARC对脂肪细胞分化的影响。首先从衰老小鼠iWAT中分离出ARCs，对其进行辐照处理以抑制分化，将这些细胞与3T3-L1细胞共培养，然后进行3T3-L1脂肪细胞分化。油红染色和明场成像（brightfield imaging）显示，对照3T3-L1细胞已完全分化为脂肪细胞。相反，与辐照的ARCs共培养的3T3-L1细胞表现出极少的脂质堆积。qRT-PCR结果显示，与ARC共培养的3T3-L1细胞中Sox9 mRNA水平提高了2倍，而分化成脂标志基因C/ebpβ、C/ebpδ、Pparγ和Fabp4的表达降低了约50%（Fig S3A）。研究人员通过使用来源于ARCs或APCs的生长培养基中检验了ARCs对3T3-L1细胞的脂肪分化的影响。与来自APCs的生长培养基相比，在ARCs生长培养基处理分化的3T3-L1细胞具有更少的脂质积累（Fig 3A）。同时qRT-PCR结果显示：在ARCs生长培养基处理的3T3-L1细胞中C/ebpβ、C/ebpδ、Pparγ和Fabp4的表达水平降低。此外，在分化的第8天，来自ARCs的生长培养基处理的3T3-L1细胞的成脂基因表达比来自APCs的生长培养基处理的细胞低约2倍（Fig 3B）。以上结果表明：ARCs可以抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）分化为脂肪细胞。研究人员也检测了CD142-high-APCs是否能抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的脂肪生成。基因分析结果显示，CD142-high-APCs不高表达抑制成脂基因，如Ddk3、Meox2、Spink1等。用APCs或CD142-high-APCs的生长培养基处理的3T3-L1细胞进行分化时，两种处理组之间的脂质油红染色并无显著差异。并且两种3T3-L1细胞表现出相似的成脂标记物水平（Fig S3B）。综上结果得出结论：在衰老小鼠的SAT中，只有ARC可以抑制邻近细胞的脂肪生成，而CD142-high-APCs则没有抑制。

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紫外辐照实验

据文献报道，紫外线A（UVA）抑制人脂肪组织来源的间充质干细胞（hAMSCs）的成脂分化，UVA降低PPARγ和CEBPα的mRNA水平，UVA还下调了PPARγ靶基因（脂蛋白脂肪酶（LPL），CD36，脂肪细胞蛋白（aP2）和肝X受体α（LXR）的mRNA水平。进一步研究发现，UVA抑制hAMSCs的成脂分化主要是通过降低PPARγ的表达，这是通过激活MIF-AMPK信号通路从而上调KLF2来介导的。本研究利用了紫外辐照处理ARC，从而抑制其成脂分化。

方法步骤：使用流式分选出ARC，预冷的PBS洗涤一遍，将细胞用PBS覆盖。然后使用以365 nm为中心的UV台照射细胞1小时。最后将辐照后的细胞与3T3-L1进行共培养。

如Fig 1C的结果中，ARCs表达大量的细胞因子。一些趋化因子及其受体，如Cxcl3和Cxcr2在之前的研究中已被报道可以促进3T3-L1细胞的脂肪分化。因此，研究人员推测ARC可能通过分泌趋化因子来影响附近的APC分化。qRT-PCR结果显示：与其他高表达趋化因子的细胞亚群（如巨噬细胞）相比，Ccl6是ARC中表达最高的趋化因子（Fig 3C）。因此，作者通过用Ccl6或对照His肽处理3T3-L1细胞，检测Ccl6对分化的影响。油红染色显示，与对照组相比，Ccl6处理后的细胞脂质减少；Ccl6处理组的Pref-1表达水平提高约2倍；成脂标志物基因：C/ebpδ、Pparγ和Fabp4的表达量则显著降低（Fig 3D）。为了进一步确定ARC对邻近细胞成脂的抑制作用是否依赖于Ccl6，研究人员将3T3-L1细胞分别培养在APC生长培养基、ARC生长培养基和加入Ccl6中和性抗体的ARC生长培养基。结果显示，ARC培养基中的3T3-L1细胞的C/ebpδ、Pparγ和Fabp4表达水平显著降低，Pref-1水平显著升高，然而APC培养组和Ccl6中和抗体组都表现出成脂标志物基因表达上升，Pref-1表达下降。上述结果表明ARC对邻近细胞脂肪分化的抑制作用是由于ARC生长培养基中分泌Ccl6。然而，ARC生长培养基加入Ccl6中和抗体组与APCs处理组显示相似水平的成脂标志物（Fig 3F）。总的来说，这些结果揭示出ARCs对前脂肪细胞（adipose precursors）的抑制分化效应与趋化因子分泌有关。

scRNA-seq分析结果显示，衰老小鼠的APCs、AFFs和SAT前脂肪细胞（preadipocytes）表达的促成脂分化因子水平均低于年轻小鼠（Fig 3E-G）。然后作者利用Pdgfrα和Pref-1分选出APCs，分析这些细胞在不培养情况下的基因表达情况。基因分析结果显示，老年小鼠iWAT中APCs的C/ebpβ和C/ebpδ水平低于年轻小鼠APCs，进一步证实了随着衰老的发展，老年小鼠的APCs相对于年轻小鼠的成脂分化能力下降。这些结果提示了ARCs对老年小鼠SAT中APCs的脂肪形成有抑制作用。然而，老年小鼠APCs中TNF-α、Ctsd（组织蛋白酶D）和Gpnmb（跨膜糖蛋白NMB）等炎症因子表达增加，可能进一步降低成脂分化能力（Fig 3G，右）。研究人员检测了从人类SAT中分离的APCs，在人类样本的Lin^-细胞中，如C/EBPδ和PPARγ等成脂基因都随着衰老而减少。这些结果表明，衰老过程中APCs的成脂分化能力下降，可能不仅是由于它们本身导致的，更可能是由于ARC的出现对它们产生的抑制作用（Fig 3H）。

有趣的是，当3T3-L1细胞在来自ARC或前脂肪细胞（preadipocytes）的生长培养基中以低密度培养48小时后，ARC细胞上清处理的细胞增殖比前脂肪细胞（preadipocytes）细胞上清处理的细胞增殖降低了50%（Fig S3C）。同样的，用His-Ccl6重组蛋白处理，低密度培养3T3-L1细胞48小时，其细胞数量比添加His肽的对照组细胞数量低50%（Fig S3D）。这些结果表明，ARCs不仅抑制前脂肪细胞（precursor cells）的成脂分化，而且可能会降低这些细胞的增殖速度。

scRNA-seq鉴定到每一种脂肪细胞亚群，如MSCs、APCs、AFFs、前脂肪细胞（preadipocytes）和早期脂肪细胞，这些细胞数量在衰老小鼠中都显示减少，在老年小鼠中更明显降低（Fig 1A）。此外，衰老小鼠的MSCs中干细胞静止基因（quiescence genes）的表达量增加，而APCs则表现为增殖相关基因的表达水平降低（Fig S3E）。相似的，CD142-high-APCs、AFFs和前脂肪细胞（preadipocytes）表现出增殖相关基因的表达降低，这与衰老小鼠细胞数量的急剧减少有关。

接下来，研究人员在体内验证了前脂肪细胞（adipose precursors）增殖能力的降低。通过给小鼠注射EdU，使用Pref-1和Pdgfrα从Lin^-细胞中流式细胞分选出APCs。经EdU染色后的APCs进行FACS分析，结果显示与年轻小鼠相比，老年小鼠的EdU⁺ APCs百分比显著降低（Fig 3G，左），同时研究人员采用MTT法进一步证实了其增殖能力的降低。流式分选后，从年轻和老年小鼠中分离的相同数量的APCs以低密度接种并培养48h。老年小鼠APCs的细胞数量始终要比年轻小鼠少，这一结果表明APCs不会在衰老过程中增殖。总之，在衰老过程中，前脂肪细胞（adipose precursors）的数量显著降低，且成脂相关基因表达显著减少，可能是由于ARC在衰老中的出现积累并抑制脂肪分化。

Fig 3 | ARC分泌细胞因子抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化

Fig S3 | ARC缺乏成脂能力并抑制邻近祖细胞的增殖

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 Pu.1在ARC形成和功能中的作用

研究人员在ARCs的基因表达谱中（Fig 2D）发现， Pu.1在ARCs中的表达量是前脂肪细胞（preadipocytes）的90倍，表达量是所有转录因子中最高的。之前的研究表明Pu.1可以将成纤维细胞转化为巨噬样细胞。研究人员推测Pu.1可能参与衰老过程中ARC的形成。为了验证这一假设，研究人员在3T3-L1细胞中过表达GFP标记的Pu.1，用FACS分离GFP+细胞。qRT-PCR和免疫印迹结果表明Pu.1显著过表达（Fig 4A）。当Pu.1过表达时，ARC标记物Lgals3的表达增加约3.5倍，这表明3T3-L1细胞表型向ARC样细胞转换。此外，在Pu.1过表达的3T3-L1细胞中，巨噬细胞标志物基因，如Rhoa和Sp3的表达量也显著增加，免疫细胞分化过程的相关转录因子（如Bax和NF-kB1）和趋化因子（如Ccl6）水平升高，Fli1表达也显著增加。同时，过表达Pu.1后，Col1a1和Col3a1表达水平显著降低（Fig 4B）。研究人员对过表达Pu.1的3T3-L1前脂肪细胞（preadipocytes）进行常规RNA转录组测序（Fig 4C）。结果显示大多数富集的基因是免疫细胞调节基因：如白细胞分化、趋化因子产生、白细胞聚集和炎症反应等基因。过表达Pu.1显著增加趋化因子Ccl12和Ccl6表达。相比之下，降低的基因主要是与脂肪形成有关的基因如C/ebpβ和C/ebpδ；以及粘附分子：包括Col1a2、Col3a1和Col5a2。综上所述，过表达Pu.1后的3T3-L1细胞的基因表达变化显示出ARCs细胞亚群的特征（Fig 4D），表明Pu.1是ARCs发育的关键转录因子。

上述结果表明ARCs对脂肪细胞分化有抑制作用（Fig 2F）。接下来，研究人员检测过表达Pu.1的3T3-L1细胞是否能够分化成脂肪细胞。结果显示：与对照3T3-L1细胞不同，过表达Pu.1的细胞不贴壁生长，这反映了它们粘附蛋白的表达降低。油红染色结果显示：过表达Pu.1的细胞分化后的脂质积累降低，Pref-1的mRNA水平是正常细胞的4倍，而C/ebpδ、Pparγ和Fabp4等成脂基因的表达低于对照正常细胞，这些结果提示过表达Pu.1的脂肪细胞分化受损（Fig 4E）。综上所述，Pu.1是ARC功能表型的关键驱动因子。

为了研究Pu.1是否参与ARC的发育，研究人员使用了两种不同的Pu.1 shRNA慢病毒，在分选后的ARC中进行Pu.1 KD检测。qRT-PCR结果表明两种Pu.1 shRNA的敲低效率均有90%左右。在脂肪细胞分化后，与对照shRNA处理的ARC相比，Pu.1 shRNA处理的ARC显示出更高的脂质积累。并且Pu.1 KD细胞的Sox9表达水平降低了2倍，脂肪生成标志物基因C/ebpδ和Pparγ增加了4倍以上（Fig 4F）。综上所述，这些数据表明，Pu.1对衰老过程中ARC的发育至关重要。

Fig 4 | Pu.1在ARC形成和功能中的作用

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Pu.1是ARC抑制邻近细胞脂肪生成功能的关键转录因子

研究人员检测ARC对邻近细胞的抑制作用是否需要Pu.1，于是将3T3-L1细胞在对照ARC和Pu.1-KD-FACS分类的ARC的生长条件培养基中培养。诱导分化后，在Pu.1 KD ARC生长培养基中培养的细胞脂质积累水平高于对照组。qRT-PCR结果表明在分化第0天，与对照组相比，Pu.1KD ARC培养液处理的3T3-L1细胞的Sox9基因表达水平更低，而C/ebpδ、Pparγ和Fabp4表达水平更高。在分化第8天，在Pu.1 KD ARC组的Sox9表达降低约3倍，C/ebpδ、Pparγ和Fabp4水平升高4倍（Fig 5A）。这些结果说明，Pu.1在ARC抑制邻近细胞成脂分化过程中起关键作用。

为了进一步验证Pu.1是否是ARCs对邻近细胞的抑制作用的关键因子，研究人员进行了体内移植实验。研究人员通过感染过表达Pu.1慢病毒，然后进行抗性筛选，构建稳定过表达Pu.1的3T3-L1细胞。该细胞系不仅Pu.1表达水平升高，而且Lgal3、TNF-α、Ccl6、Flil的表达水平也升高，粘附蛋白如Colla1、Col5a1表达降低（Fig S4）。因此，稳定过表达Pu.1的3T3-L1细胞表现出类似Fig 4中瞬时表达Pu.1的3T3-L1细胞的基因表达谱。然后，将表达GFP的3T3-L1细胞与表达Pu.1的3T3-L1细胞混合，然后将它们与基底胶混合，皮下注射到免疫缺陷型的SCID小鼠中。12天后，收集移植后的小鼠脂肪进行分选，再检测免疫荧光和qRT-PCR（Fig 5B）。移植物采用LipidTox或DAPI染色。对照组GFP⁺ 3T3-L1细胞经脂质染色形成大量脂肪细胞。相比之下，过表达Pu.1的3T3-L1细胞形成的脂质明显降低，表明Pu.1可以显著抑制脂肪生成。更重要的是，当GFP⁺ 3T3-L1细胞与稳定表达的Pu.1细胞一起植入时，与单独植入GFP⁺细胞相比，混合稳定表达的Pu.1细胞和GFP+ 细胞形成的脂质更低（Fig 5C），qRT-PCR显示C/ebpβ、C/ebpδ、Pparγ和Fabp4显著降低。这些结果表明，过表达Pu.1不仅抑制脂肪生成，而且抑制体内邻近前脂肪细胞（preadipocytes）的分化。综上所述， Pu.1是ARC发育及功能作用的关键因子，并且ARC可以抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的分化。

Fig S4 | 3T3-L1过表达增加了ARC中高表达的基因

Fig 5 | 体内稳定表达的Pu.1细胞表现出分化缺陷，并抑制附近前脂肪细胞的脂肪生成

 总结

本文中，研究人员通过比较年轻和衰老小鼠的SAT中的总的SVF细胞的scRNA-seq，鉴定并命名了一种仅在衰老小鼠和人的SAT中出现的ARCs亚群。ARCs表达脂肪祖细胞分子标记物基因，成脂分化相关基因表达降低。ARCs分泌高水平的促炎性趋化因子Ccl6以抑制邻近前脂肪细胞的增殖和分化。此外，Pu.1是ARC发育及功能发挥的关键转录因子。总而言之，文中揭示了一种ARC细胞亚群，其存在抑制邻近前脂肪细胞分化的能力，这对衰老中皮下脂肪相关的功能衰退提供新的分子机制。