一位WB可以稳定跑出重复结果的同仁的WB精髓与经验分享-丁香园论坛

xzc112发布于 10:55

我们都习惯把WB叫做'玄学',意思就是这门技术让人琢磨不透,很难做到结果可重复,明明上了两个相同体积的同个样品,可总是这两个泳道的条带趋势不一致。然而,经过我一年半的摸索,我可以做到了这一点,我做WB 90%的结果都可以重复,所以我被我们实验室称为'WB之神'。今天我就想各位同行分享一下我的经验,需要的就看看,如果已经是'WB大神'的也请看看,欢迎指正!

我们知道WB实验步骤繁琐,一次实验历时也不短,从提蛋白到显影结束可能要三天,我们就讲一下这里面的一些关键环节,就不面面俱到了。

一、蛋白提取及变性

1、提取蛋白 最重要的是防降解和保证蛋白浓度不要太低。防降解主要有两点,一是裂解前注意保持样品处于低温环境中,二是裂解时加入足够的蛋白酶抑制剂。接着是保证蛋白浓度,即要加入适量的裂解液,加太少会使蛋白提取不充分,加太多会让蛋白浓度太低,一般经验是这样的,细胞样品例如一个六孔板的细胞加60微升的裂解液,动物组织的话每毫克组织加10微升裂解液。

2、蛋白变性 加入上样缓冲液后100摄氏度煮10分钟,这里的上样缓冲液有两种可选,一种是用beta巯基乙醇打开蛋白质分子二硫键的,另一种是用DTT(二硫苏糖醇)。两者的作用是一样的,但特点不一样,前者更容易与氧气反应,稳定性比后者差,如果在常温下暴露在空中,前者只能维持24小时的活性,后者却可以维持7天左右。所以该如何选择?如果是蛋白样品较少,跑几次就可以用完的样品,这时选择beta巯基乙醇。如果样品很多,计划跑上几十次的,优先选择DTT,但也还建议变性后分装保存。

二、SDS-PAGE凝胶配制

1、配胶前准备 首先强调一下,一块好的胶是跑好蛋白的前提,所以这个环节也不容忽视。玻璃板的选择,一种是1毫米厚度的,另一种是1.5毫米的,这个厚度选择也是有讲究的,如果上样体积小于10微升,优先选1毫米,否则选1.5毫米的。原因是什么?答案在转膜部分揭晓。还有分离胶的浓度也要选择适合的。然后玻璃板和梳子要洗干净,晾干。装板,注意厚板和薄板的底部要对齐,否则会漏胶。加制胶的各成分前,要观察液体是否有沉淀,有沉淀的尽量不要用。

2、制胶 按配方说明依次加入各组分,加完SDS后先简单手动摇匀几下,然后迅速加入过硫酸铵和TEMED,紧接着就灌胶。然后我习惯用95%的酒精压胶,我也用过纯水,感觉纯水压没那么好,由于水的密度较大,会把分界处的胶压得膨大。静置25分钟后把酒精倒干,用吸水纸吸出多余的酒精,然后配压缩胶,同样的操作,关键是梳子要插得快,要小心梳子下产生气泡,然后静置30分钟。如果是当天跑胶,我会等上层胶凝2个小时再用。所以我一般提前一晚制胶。

三、蛋白电泳

1、上样前准备 找把胶组装到电泳芯上,注意密闭性,如果内槽漏液就不是匀强电场了,最后条带可能就不是一条直线。然后内槽倒满电泳液,拔梳子,这一步要小心,梳子要两边一起缓缓往上拔出,然后观察泳道内有无脱落的胶粒或者胶丝,有的话用1毫升注射器吸出。然后从冰箱取出蛋白样品,解冻。准备振荡器。

2、上样和电泳 注意,上样后蛋白会开始慢慢在胶中弥散,所以上样越快越好。我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品,蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡,吸的时候没有拉丝即可。上层胶80V 25分钟,下层胶120V 65分钟。

四、转膜

1、转膜前准备 我会在电泳结束前30分钟准备,把转膜液配好置于4度冰箱预冷,然后裁膜,准备转膜装置,准备碎冰和冰砖。最后把膜活化1分钟,然后转移至转膜液中。

2、转膜 组装转膜三明治夹,这一步很关键,最重要的是胶和膜之间不能有气泡,可以加多点转膜泡着。组装好后加满转膜液,设置电源参数,我习惯恒流转膜,200-280毫安,1-2小时,根据分子量定。如果一个电源带两个转膜大槽即四块胶,我就会用恒压70-110V。这个过程最重要的是做好降温。这里简单说一下蛋白分子量与玻璃板厚度,分离胶的浓度,转膜电源参数的选择问题。如果是能用1毫米的玻璃板就不用1.5毫米的,因为转膜是在电场的作用下蛋白分子从胶上迁移到膜上,1毫米胶的蛋白迁移距离要比1.5毫米的短1/3。选择更薄的胶蛋白转膜时间可以减少,从而减少发热,以免胶变形,条带也会更好看。然后是分离胶的浓度,如果是150KD以上的分子选10% 以下的的分离胶,200KD以上的选8%的,转膜条件用280毫安,120分钟足矣。

五、封闭孵一抗

1、封闭 转膜结束后,把膜先用TBST泡洗两遍再用5%脱脂奶粉或者BSA室温封闭1-2小时。注意一定要让蛋白面充分接触封闭液。

2、孵一抗 脱脂奶粉封闭的话,要用TBST泡洗三遍在转移至一抗溶液中,BSA封闭的可以直接转移至一抗中。如果膜的宽不大于8毫米,我习惯置于15毫升离心管中孵育,两条膜'背对背'式放置于一个管子里(3毫升液体即可)。如果大于8毫米,就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可)。4度过夜,一般是12-18个小时,注意放置水平,最后用摇床。内参等蛋白丰富很高的如果孵久了可能出现条带连在一起的情况,这时可以缩短孵育时间或者降低一抗的浓度。

六、孵二抗显影

1、孵二抗 这步要注意的是建议用5%BSA或者脱脂奶粉溶解二抗,这样背景会干净许多。也要注意膜的蛋白面要充分接触二抗溶液,我一般一条膜一个槽地孵。

2、显影 这一步有个细节可能有些同学没注意到,就是ECL发光液要与HRP反应一分钟后显影效果才会更好。

今天先讲这么多,如果想讨论更多细节问题,欢迎在评论区留言!也望得到大神指正!最后祝大家实验顺利!

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