高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书

【产品名称】通用名称：高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）【包装规格】:作I者：疾控科研试剂博客联I系：I99I-4747-I94单管单人份，24人份/盒。【预期用途】本试剂盒适用于定性检测人宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中 18 种高风险 HPV DNA，包括(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82），其中，可特异性区分 16 型和 18 型 HPV。由于未做相关验证，本产品不能用于宫颈癌筛查相关用途。本试剂盒采用4 种荧光标记物，其中，HEX 标记常见高风险型 HPV 16型探针，TEXRD 标记常见高风险型 HPV 18 型探针，FAM 标记另外 16 种 HPV 基因型（26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）探针，CY5 标记内标基因探针，实现了在同一管扩增体系中检测 18 种 HPV 基因型。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。【检测原理】本试剂盒以 HPV 基因组 L1 变异区为靶区域，设计针对 18 种高风险 HPV 基因型的特异性引物探针组合，用不同的荧光标记将常见的高风险型别 HPV 16 型（HEX 标记），HPV18 型（TEXRD 标记）与另外 16 种基因型（FAM 标记）区分开来，并设计了内标引物探针（CY5 标记）对样本和实验过程加以监控。配以 DNA 聚合酶等成分组成核酸扩增试剂；样本提取采用快速核酸提取方法，提取的病毒核酸加入配制好的核酸扩增反应体系中，使用荧光 PCR 仪进行快速 PCR 扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，实现对未知样本的检测。【主要组成成分】试剂盒组分名称规格数量主要成分细胞裂解液1200µl /管1Tris-HClHR HPV PCR 反应管单管单人份24Taq 酶、UNG 酶、特异性引物、特异性探针、固体封盖剂（石蜡）、Tris 盐酸 Buffer阴性质控品100µl /管1纯化水HPV 阳性质控品100µl /管1HPV18 型感染的 Hela 细胞注：1. 需要自备的试剂：无菌生理盐水。2. 不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。3. 可使用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，也可使用商品化的核酸提取试剂盒：广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备 20140038 号）。4. 本试剂盒组分不包含配套的样本采集设备。【储存条件及有效期】试剂盒保存于-20±5℃，避免反复冻融，有效期 9 个月。运输采用干冰（或者冰袋）保持低温，72 小时内不影响本试剂盒的检测性能。试剂使用时开瓶（复融）8 小时内其检测性能不受影响。试剂使用前反复冻融次数不应超过 4 次。试剂盒生产日期详见产品标签。【适用仪器】AB 7500 RealTime PCR System。【样本要求】1. 适用样本类型：宫颈脱落细胞，生殖泌尿道分泌物。2. 受检需知：月经正常妇女，在月经来潮后 10～18 天为最佳检查时间；检查前3 天内不应使用阴道内药物或做阴道冲洗；检查前 24 小时内不应有性行为。3. 样本采集：3.1宫颈脱落细胞：医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转 4－6 周以获取足量的上皮细胞，然后取出宫颈刷置于盛有 2ml 生理盐水的无菌小试管中备检。若样本黏液过多或者含血量过多应该尽量重新取样。3.2 生殖泌尿道分泌物：3.2.1女性尿道样本：首先使用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用棉拭子插入尿道约 2CM，然后捻动棉拭子，最后将棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。采集尿道样本时，受检者必须在采集前 2 个小时禁止小便。3.2.2男性尿道样本：使用细小的尿道棉拭子，插入男性尿道 2-4CM，然后捻动尿道棉拭子取出分泌物，最后将尿道棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。4. 样本保存和运送：通常情况下，宫颈脱落细胞样本采集后置于生理盐水的无菌小试管中，生殖泌尿道分泌物样本采集后置于细胞保存液中，均可立即用于测试。如需保存，置于 2-8℃保存不应超过两周，-20±5℃保存不应超过一年。样本运送时应采用 0℃冰壶。1注：样本采集及保存中使用的宫颈刷和细胞保存液，推荐使用江苏健友医疗科技有限公司生产的一次性使用无菌宫颈采样器和细胞保存液。【检验方法】1.样本处理和核酸提取（样本处理区）本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；HPV 阳性质控品参与提取，用于 PCR 检测试剂的质控。可采用广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒（核酸提取或纯化试剂：粤穗械备 20140038 号），具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。也可采用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，该提取试剂含有颜色示踪剂，能指示模板加入与否。具体操作如下：1.1 振荡宫颈刷保存管或棉拭子保存管 10-30 秒，使细胞充分落入液体，取振荡后液体 0.5ml-1.0ml（如果细胞数量少可以加大体积到 1.5ml）转至 1.5ml 离心管中 ；1.2 10,000rpm 离心 3 分钟，弃上清；1.3 样品沉淀中加入 1ml 无菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm 离心 3 分钟，弃上清；1.4 样品沉淀中加入 50µl 细胞裂解液，振荡 60 秒，充分悬浮细胞沉淀，备用；1.5 质控品处理：取装有 HPV 阳性质控品、阴性质控品的离心管，10,000rpm 离心 30 秒，然后按 1.3～1.4 的处理步骤操作。2.核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）2.1 从试剂盒中取出 HR HPV PCR 反应管，5,000rpm 离心 5 秒后,备用；2.2 往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸20µl（如样本不足 20µl，请用纯化水补足至 20µl 后加样）及提取后的阴性质控品、阳性质控品各 20µl。盖紧管盖，5,000rpm 离心 30 秒后转移至扩增检测区。3. PCR 扩增（扩增检测区）3.1 将反应管放入仪器样品槽3.2  AB 7500 RealTime PCRSystem 仪器设置3.2.1  打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品（NTC）、阳性质控品以及未知样本（Unknow），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称，探针检测模式设置为：TargetDetectorReporter DyeQuencher  DyeName16 种常见高风险 HPV 基因型（26、31、33、35、39、FAMFAMNONE45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）HPV16HEXVIC/HEXNONEHPV18TEXRDTEXAS RED/ROXNONE内标基因（PPIA）CY5CY5NONEPassiveNONEReference3.2.2 打开instrument窗口，设置循环条件如下：程序温度时间循环数Segment150℃3 分钟195℃5 分钟Segment295℃5 秒4558℃（采集荧光）31 秒反应体积 50µl，保存文件，运行4.结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在 3～15、End 值可设在 5～20，在 Log 图谱窗口设置 Threshold 的 Value 值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），建议将阈值线调至各个通道的最高荧光值的 1/20，例如本试剂盒用到四个通道，实验结束后需分别调 FAM 通道、HEX 通道、TEXRD 通道和 CY5通道的阈值线至各个通道最高荧光值的 1/20，点击Analysis 自动获得分析结果，记录样本 Ct 值结果。5.质量控制样品名称FAM 通道HEX 通道TEXRD 通道CY5 通道（内标通道）结果阴性质控品无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线阴性HPV 阳性质控品无明显对数扩增曲线无明显对数扩增曲线有明显对数扩增曲线，Ct≤有明显对数扩增曲线，Ct≤阳性3737以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。【阳性判断值或者参考区间】使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的 Ct 值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒 Ct 值大于 37 时，均属于阴性组，当本试剂盒 Ct 值小于或等于 37 时，均属于阳性组。因此，将 Ct 值等于 37 作为本试剂盒的参考值（CUTOFF 值）。【检验结果的解释】举例说明部分可能出现的检验结果分析如下表所示：样品名称FAM 通道HEX 通道TEXRD 通道CY5 通道（内标通结果判断道）Sample n无明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增该样品为阴性曲线曲线曲线曲线，且 Ct≤372Sample n+1有明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增该样品为除 HPV 16，18 型外的其他 16 种 HPV 高风曲线，且 Ct≤37曲线曲线曲线，且 Ct≤37险型一个或多个型别阳性Sample n+2无明显对数扩增有明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增该样品为 HPV16 型阳性曲线曲线，且 Ct≤37曲线曲线，且 Ct≤37Sample n+3无明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增有明显对数扩增该样品为 HPV18 型阳性曲线曲线曲线，且 Ct≤37曲线，且 Ct≤37Sample n+4有明显对数扩增有明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增该样品为 HPV16 型阳性和除 HPV 16，18 型外的其曲线，且 Ct≤37曲线，且 Ct≤37曲线曲线，且 Ct≤37他 16 种高风险型的一个或多个型别的混合阳性Sample n+5有明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增有明显对数扩增该样品为 HPV18 型阳性和除 HPV 16，18 型外的其曲线，且 Ct≤37曲线曲线，且 Ct≤37曲线，且 Ct≤37他 16 种高风险型的一个或多个型别的混合阳性Sample n+6无明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增无明显对数扩增该样品为 HPV18 型阳性（采样时病毒载量大，取得曲线曲线曲线，且 Ct≤33曲线的细胞核少的情况）Sample n+7无明显对数扩增有明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增该样品为 HPV16 型阳性（采样时病毒载量大，取得曲线曲线，且 Ct≤33曲线曲线的细胞核少的情况）Sample n+8无明显对数扩增无明显对数扩增有明显对数扩增有明显对数扩增该样品加样浓度低于本试剂盒检测灵敏度，该样品曲线曲线曲线，但 Ct>37曲线，但 Ct>37为阴性，建议重新提取样本 DNASample n+9有明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增未检测到内参基因，请重新制备待检样品，再次检曲线，且 33<Ct≤曲线曲线曲线测37Sample n+10无明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增无明显对数扩增未检测到内参基因，请重新制备待检样品，再次检曲线曲线曲线曲线测Sample n+11除上述情况外的除上述情况外的除上述情况外的除上述情况外的请重新检测或询问技术支持人员其它情况其它情况其它情况其它情况1. 阴性结果报告格式为：本试剂盒对该样本未检测到HPV DNA；2. 阳性结果报告格式为：本试剂盒对该样本检测到HPV DNA（并可根据需要提供检测样本的具体结果，如 Ct 值或曲线图作为参考）；3 采样时，在出现样本的病毒载量大，取得的细胞核少的情况下，FAM通道/HEX 通道/TEXRD 通道和 CY5 通道（内标通道）之间有可能会存在竞争，所以会出现 FAM 通道/HEX 通道/TEXRD 通道为相应型别阳性（有明显对数扩增曲线，且 Ct≤33），而 CY5 通道（内标通道）无明显对数扩增曲线的情况，此种情况下结果判断为相应通道对应型别的阳性；4. 本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段；5. 示例：（阈值根据样本曲线调整至对数生长区，FAM、HEX、TEXRD 和 CY5 荧光强度不同，可分别调整后输出对应 Ct 值，此处不再单独给出调整阈值后的实验结果曲线图）本试剂盒为阳性检测结果的示意图如下：

【检验方法的局限性】1. 本试剂盒为定性检测试剂，可通过分析荧光来区分HPV16 型（HEX 标记）和 HPV18 型（TEXRD 标记），但针对除 HPV16 型和 HPV18 型外的其他 16 种高风险型别，则只能确定是否存在感染，无法确定感染类型为单一或混合感染，无法给出确切的 HPV 感染型别。2. 本试剂盒不能检测 HPV 低风险型感染。3. 样本检测结果和样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将可能导致假阴性结果。4. 如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。【产品性能指标】1.产品分析性能评估结果表明：1.1 本试剂盒可用于检测 18 种 HPV 基因型别的 DNA 样本，对18 种 HPV 型别（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）的质粒样本、质粒与阴性的宫颈脱落细胞的混合物样本、质粒与阴性的生殖泌尿道分泌物的混合物样本，各选用三个连续浓度梯度作为待测样本，使用合格的连续三批试剂，进行重复性检测，通过分析检测结果的阳性检出率，得出本试剂盒对 18 种 HPV 型别的检测灵敏度均达到 5×103 拷贝/ml；31.2 与其它非本试剂盒检出范围内的常见 HPV 型别（如 6/11/40/42/43/44/54/61/67/69/70/71/72/81/CP8304/83）、与种属相近或引起症状相似的其他病原体（如沙眼衣原体、解脲脲原体、单纯疱疹病毒 2 型、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫等）无交叉反应；1.3样本中可能存在的内源性物质（血液、宫颈粘液等）对检测结果不产生干扰，其中，血液浓度达到 10%时对检测结果无影响，宫颈粘液浓度达到 20%时对检测结果无影响；样本中可能存在的外源性物质如α-干扰素（100 万单位/ml）、壬苯醇醚（10mg/ml）、克霉唑（1mg/ml）、咪康唑（1mg/ml）、洁尔阴洗液（浓度为 10%），在本试剂盒的实验条件下，对检测结果不产生干扰。2.临床研究试验：本试剂盒共检测样本 1210 例，与对照试剂相比，本试剂盒的阳性符合率为 100%，阴性符合率为 96.26%，总符合率为 98.68%。【注意事项】1. 本试剂盒仅用于检测以下 18 种高风险型HPV：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82。2. 实验前请仔细阅读本说明书。3. 本产品不得用于宫颈癌筛查相关用途。4. 仪器使用请参考仪器配套用户手册。5. 为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜；样本的处理建议在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器（HPV 为接触感染，请实验员做好自身防护）；样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。6. 实验室管理应严格按照 PCR 基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区）；实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无 DNA 酶、RNA 酶的离心管和吸头。7. 试剂盒中组分需在效期内使用，不使用本试剂盒提供的组分进行实验将可能导致错误结果。8. PCR 检测试剂使用前要完全解冻，瞬时离心后使用，但应避免反复冻融。9. 完成样本核酸处理后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20±5℃待用。10.如果在标本处理中存在交叉污染，可能出现假阳性。11.对每次实验进行质量控制。12.标本处理时“弃上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀。13.实验完毕用10%次氯酸或 75%酒精处理工作台和移液器，并用紫外线灯照射20-30 分钟。14.本试剂盒内的阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。【参考文献】1.    Wright TC Jr, Schiffman M: Adding a test forhuman papillomavirus DNA to cervical-cancer screening. N Engl J Med.2003;348:489–90.2.    MuñozN, Bosch FX, de Sanjose S, et al. Epidemiologic classification of humanpapillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med. 2003;348(6): 518-27.3.Unger ER, Dillner J, editors. Human Papillomavirus Laboratory Manual.   1stEdition   Geneva:WorldHealth   Organization;2009.4.Bouvard V, Baan R, Straif K, et al. A review of human carcinogens - Part B: biological agents. Lancet Oncol. 2009;10:321–2.5.Castle   PE,Schiffman   M,   Wheeler   CM,   et al.   Impact   of improvedclassification   ontheassociation   of   humanpapillomavirus   with   cervicalprecancer.Am J Epidemiol. 2010;171:155–63.6.    DeSanjose S, Quint WG, Alemany L et al. Human papillomavirus genotype attributionin invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study.Lancet Oncol. 2010 ;11(11):1048-56.7.    KatkiHA, Kinney WK, Fetterman B, et al. Cervical cancer risk for women undergoingconcurrent testing for human papillomavirus and cervical cytology: apopulation-based study in routine clinical practice. Lancet Oncol.2011;12(7):663–72.8. Saslow D,Solomon D, Lawson HW, et al. American Cancer Society, American Society forColposcopy and Cervical Pathology, and American Society for Clinical Pathologyscreening guidelines for the prevention and early detection of cervical cancer.CA Cancer J Clin 2012;62(3):147–72.4