柳叶刀子刊丨臻和多重免疫荧光检测（MIF）助力何建行/梁文华团队在肺癌免疫微环境取得最新进展

广州医科大学附属第一医院、国家呼吸医学中心何建行教授、梁文华教授团队在免疫浸润细胞及微环境方面取得系列研究进展，揭示了肿瘤微环境内复杂的免疫结构和细胞亚群，并证实其在预后及免疫疗效预测中的作用。成果分别发表于国际免疫学会联合会（IUIS）的官方期刊“Frontiers in Immunology”（IF=7.561）^[1]及《柳叶刀》子刊“EClinicalMedicine”^[2]。其中，免疫微环境研究采用了臻和基因多重免疫荧光检测技术平台。

成果一

成果二

PART Ⅰ

Profiling tumor immune microenvironment of non-small cell lung cancer using multiplex immunofluorescence

肺癌的发生发展除了依赖于肿瘤细胞的内部机制外，还依赖其与免疫微环境内适应性免疫细胞和固有免疫细胞等不同成分之间复杂的相互作用。免疫细胞的位置、类型、密度和功能状态构成了肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)的免疫结构，在患者之间存在较大的个体差异，是患者对治疗的应答率及预后的重要决定因素。在肺癌领域，既往有研究提示个别免疫细胞类群的预测及预后指示意义，但是，多种免疫细胞类群之间的数量、空间相关性及其相互作用机制在很大程度上仍属未知，有待进一步探索。

本研究利用臻和基因的多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence, MIF)检测技术平台对681例涵盖IA~IIIB期的原发非小细胞肺癌样本的10个免疫靶标同时进行检测，旨在揭示TIME内复杂的免疫结构。

基于本研究的重要小结

01

揭示了TIME内多种免疫细胞类群及其相关性

02

识别了三种免疫特征、临床病理特征和预后差异显著的免疫亚型，分别为激活型、豁免型和驯化型

03

探究了26种免疫细胞类群在不同空间位置（包括癌巢和基质）的预后指示意义

04

基于6种细胞类群构建了免疫相关风险评分模型(immune-related risk score, IRRS)，可有效预测患者复发风险

研究队列与分析方法

01

本研究为回顾性队列研究，纳入681例从2009年至2011年在广州医科大学附属第一医院行肺叶切除/亚肺叶切除及淋巴结清扫术的IA~IIIB期非小细胞肺癌患者，结局指标为无病生存期 (disease-free survival, DFS)。

02

采用臻和MIF技术平台对原发肿瘤病灶的10种免疫靶标，包括CD4、CD38、CD66b、FOXP3、CD20、CD8、PD-L1、CD163、CD68、CD133的数量、密度、百分比及空间位置（癌巢和基质）进行检测

03

基于非监督一致性聚类算法，从免疫靶标的表达量（百分比）和空间位置水平对样本进行分类，在此基础上比较各亚型的免疫图景、临床病理特征及预后差异。

04

利用Cox和LASSO回归算法在训练队列中(n=477)筛选具有稳健预后指示意义的细胞类群，建立非小细胞肺癌IRRS预后模型，在验证队列(n=204)和总体队列(n=681)中验证模型对于肺癌复发的预测价值

研究结果

1

TIME内多种细胞类群间存在密切的数量和空间关联，如癌巢内Treg与间质内中性粒细胞与 (r²= 0.439, P<0.001)、基质内B 细胞与CD4 CD38 T 细胞 (r²= 0.539, P<0.001)、癌巢内CD133 细胞与M1 型巨噬细胞 (r²= 0.416, P<0.001)、癌巢内CD8 T细胞与表达PDL1的M2型巨噬细胞 (r²= 0.339, P<0.001)。

图一. IA~IIIB期非小细胞肺癌的免疫图景及细胞类群间的数量和空间关系

2

基于非监督一致性聚类算法，从免疫靶标的表达量和空间位置水平对样本进行分类，识别了三种免疫特征、临床病理特征和预后差异显著的免疫亚型，分别为激活型、豁免型和驯化型。免疫激活型以CD4 T细胞、B细胞、CD8 T细胞浸润为主，DFS最长；免疫豁免型以高浸润水平的Treg与中性粒细胞为特征，预后次之；免疫驯化型富含CD133 细胞与巨噬细胞，DFS最短。

图二. 识别和分析三种免疫亚型

图三. 三种免疫亚型的免疫图景

3

基于Cox比例风险回归模型对癌巢和基质内的66种免疫标记物的预后指示意义进行评估，结果显示CD4 T细胞、CD8 T细胞、巨噬细胞及其亚群是稳健的DFS预后因素，并提示了一系列免疫细胞及其亚群的预后作用。

图四. TIME内多种免疫标记物的预后指示意义

4

基于Cox和LASSO回归算法筛选出6种稳健的预后标记物，包括癌巢内CD68 巨噬细胞、M1型巨噬细胞，以及基质内CD8 T细胞、CD4 T细胞、CD4 FOXP3-T细胞、和PD-L1 细胞。根据细胞类群的含量并按其回归系数加权，构建IRRS模型计算公式：

5

基于最佳截断值将患者分为高、中、低IRRS评分组。高IRRS (HR 3.56, 95%CI 2.06-6.15, P<0.001)、中IRRS (HR 1.94, 95%CI 1.22-3.08, P=0.005) 组的复发风险显著高于低IRRS组，IRRS模型对DFS有一定的预后预测价值(AUC 0.631, 95%CI 0.579-0.683)。在训练组和整体组中得到了类似的结果。三种IRRS亚组的免疫细胞特征存在显著差异，低IRRS组以CD4 T细胞、CD8 T细胞浸润为主，而高IRRS组含有较高浸润水平的巨噬细胞及其亚型。

图五. 构建和验证IRRS模型

PART Ⅱ

The association between CD8 tumor-infiltrating lymphocytes and the clinical outcome of cancer immunotherapy: A systematic review and meta-analysis

既往的经验提示，良好的预后因素，往往也是免疫治疗疗效较优的预测因素。因此，为了初步验证前期研究发现的与肺癌预后相关的预测因素，研究团队选择了预后影响最为稳健的CD8 T细胞为对象，进一步通过系统评价与荟萃分析的方式评估了其对癌症病人接受免疫治疗疗效的预测价值，相关成果发表于《柳叶刀》子刊“EClinicalMedicine”。

研究者共纳入33项研究，包含2559例接受免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤患者的数据，结局指标包括总生存期(overall survival, OS)、无进展生存期(progression-free survival, PFS)和客观缓解率(objective response rate, ORR)。

既往研究报道PD-L1表达水平未能很好地预测免疫联合治疗的疗效，本项研究发现无论对于单一免疫检查点抑制剂用药还是联合其他疗法治疗，肿瘤浸润CD8 T细胞（无论位于癌巢内、侵袭边缘还是基质内）浸润水平越高，患者疗效越好，与MIF研究结果高度一致。

图六. 高CD8 T细胞对比低CD8 T细胞浸润在接受免疫检查点抑制剂治疗后的各种癌症患者中OS、PFS和ORR的差异

研究者还对肿瘤的类型，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤和其他实体肿瘤，进行了亚组分析，发现高浸润水平的CD8 T细胞与较长的OS、PFS和ORR相关，但未能很好地预测黑色素瘤的OS。

研究者进一步分析了CD8 T细胞的定位对其预测意义的影响，发现定位于基质内和侵袭边缘的CD8 T细胞对免疫治疗疗效的预测意义略优于癌巢内的CD8 T细胞。

图七. 不同治疗类型、肿瘤类型、CD8 T细胞定位的亚组分析

研究者还评估了基线水平外周血循环CD8 T细胞含量与OS、PFS和ORR的关联，但未发现统计学显著性。

图八.接受免疫检查点抑制剂治疗后的各种癌症患者外周血中高CD8 T细胞与低CD8 T细胞含量与OS和PFS的关联

总结

来自何建行/梁文华团队的系列研究，揭示了非小细胞肺癌肿瘤免疫微环境成分的构成和空间异质性，描述了免疫特征、临床病理特征和预后差异显著的免疫亚群，有助于深入理解不同免疫细胞之间的相互作用，根据各个亚型的生物学特征制定相应的创新治疗策略，免疫相关风险评分模型的构建则有助于预测患者的复发风险。此外，还揭示了肿瘤浸润CD8 T淋巴细胞对于癌症病人接受免疫治疗疗效的优越预测价值，其应作为PD-L1、TMB检测以外的一种必要检测因素和基线信息，研究团队与臻和基因计划在大样本前瞻性研究中进一步验证其预测价值。同时，研究团队将继续明确其他类型的免疫浸润细胞对免疫治疗疗效的预测价值。

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