小清蛋白神经元中的5-HT5A信号介导延迟抗抑郁作用

抗抑郁药的行为反应与海马齿状回（DG）神经元功能的生理变化密切相关。小清蛋白中间神经元是DG区里一类主要的GABA能神经元，与多种神经精神疾病的病理生理相关。然而，目前关于这些神经元在重度抑郁症中的作用或在调节抗抑郁药延迟行为反应中的作用，我们知之甚少。

选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）可以通过促进齿状回（DG）的部分突触、细胞和网状系统发挥作用。两类不同的5-HT1B和5-HT2A血清素受体对SSRI的急性和慢性反应至关重要。它们可以被5-羟色胺（5-HT）立即激活，改变颗粒细胞和小清蛋白（PV）神经元的活性，并产生抗抑郁反应。PV中间神经元的激活促进新生颗粒细胞的存活和发育，这一过程与慢性SSRI治疗相关，但PV神经元是否直接受5-HT调节目前尚未确定。

研究结果：

研究人员在实验过程中使用了免疫组织化学、电生理和行为分析等方法。为了研究PV神经元上是否存在5-HT受体，采用了翻译核糖体亲和纯化（TRAP）法，培育出PV-TRAP条件性敲入小鼠。结果显示5-HT5A受体在海马PV神经元中富集。研究人员将急性海马切片进行全细胞膜片钳，以记录DG区的PV神经元活动，发现在静息条件下快速使用5-HT（1–100µM）不会引起膜电位的任何变化。然而，在使用氟西汀慢性治疗3周后，应用5-HT会导致PV神经元膜电位的超极化反应。这种对5-HT的反应会被5-HT5A受体拮抗剂SB 699551阻断。另外，研究人员发现氟西汀治疗对PV神经元的5-HT5A受体mRNA或蛋白质免疫标记均无影响，但会导致海马裂解物膜部分的5-HT5A水平升高，这表明慢性氟西汀可能导致受体移位至细胞膜。

Fig1.氟西汀治疗后5-HT5A对DG区PV神经元的抑制

研究人员通过急性海马脑片全细胞膜片钳记录，研究了5-HT通过5HT5A受体对PV神经元生理学的影响。结果显示：应用5-HT可以降低氟西汀治疗后野生型（WT）小鼠神经元的放电频率，但这不适用于处理后的WT小鼠或cKO小鼠。此外，通过使用SB 699551阻断5-HT5A受体，这种效应会被部分逆转，然而5-HT2A受体不会影响这些神经元的放电。先前的研究表明，5-HT5A通过G蛋白偶联的内向整流钾通道（GIRKs）发挥作用。然而，应用5-HT（30µM）对氟西汀治疗的WT或cKO小鼠的DG区PV神经元的GIRK电流振幅没有影响。

研究人员接下来研究了氟西汀治疗前后5-HT对Kv电流振幅的影响。应用5-HT可将氟西汀治疗的WT小鼠的DG区PV神经元的Kv电流幅度降低近50%，而对经过治疗的WT或cKO小鼠无影响。

为了研究慢性SSRIs是否可以通过调节通道的磷酸化水平来调节Kv电流，研究人员量化了氟西汀治疗的WT和cKO小鼠的DG区PV神经元中pKv3.1β的水平，并观察到氟西汀治疗后WT小鼠中表达pKv3.1β的PV神经元比例显著增加。此外，Kv3.1磷酸化形式表达的增加与氟西汀治疗后出现5-HT对PV神经元放电频率影响的时间进程相关。

Fig2.  5-HT5AR介导慢性氟西汀治疗后Kv电流的抑制

为了检测5-HT5A对cAMP水平的影响，研究人员采用体外方法，对转染不同浓度5-HT5A受体的N2A细胞进行处理。随着5-HT浓度的增加，forskolin诱导的cAMP水平逐渐降低，这表明5-HT5A的激活可能抑制蛋白激酶A（PKA）的活性。研究人员接下来测试了PKA活性的变化如何影响Kv通道的磷酸化。为了验证cAMP信号可以减弱Kv3磷酸化的假设，用腺苷酸环化酶激活剂forskolin处理HEK293细胞，结果显示可以减少由PKC激活剂Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）诱导的磷酸化Kv3.1（pKv3.1）的数量，这种减少可以通过添加PP2A抑制剂okadaic acid来逆转，表明PKA和PKC对Kv3.1β通道的磷酸化和功能具有拮抗作用。此外，在全细胞膜片钳实验中，添加PMA可降低氟西汀治疗的WT小鼠DG区PV神经元的Kv电流振幅，然而5-HT没有明显作用，这进一步支持在慢性SSRI治疗过程中，膜结合-Gi偶联5-HT5AR的激活将降低cAMP水平，并解除丝氨酸503处Kv3.1β的磷酸化的观点。

Fig3.  5-HT5A在PV神经元中的信号传导

研究人员又研究了PV神经元中5-HT5A受体在调节SSRIs行为反应中的作用。慢性氟西汀治疗可显著降低强迫游泳试验（FST）中WT小鼠的不动性，但对cKO小鼠没有效果。在悬尾试验（TST）中，慢性氟西汀治疗降低了WT小鼠的不动性，但对cKO小鼠疗效甚微。在陌生环境摄食抑制（NSF）中，慢性氟西汀治疗减少了WT小鼠接近食物的潜伏期，但没有减少CKO的潜伏期。相反，单次急性注射氟西汀在WT和cKO小鼠中产生大致相同的行为反应，这表明了5-HT5AR仅对慢性抗抑郁药有反应。与野生型小鼠相比，5-HT5A cKO小鼠的氟西汀日摄入量和NSF试验中摄入的食物颗粒量没有差异，排除了这些小鼠的代谢缺陷。

研究人员为了证实PV神经元中5-HT5AR在介导慢性SSRI行为反应中的作用。为此，将表达GFP或5-HT5A的AAV-Flex定向注射到DG上，以观察5-HT5A cKO小鼠5-HT5A的水平。免疫染色实验证实了这些转基因表达的空间和时间特异性。研究人员发现恢复cKO小鼠PV神经元中的5-HT5A水平可以恢复慢性氟西汀治疗的抗抑郁反应，然而在WT小鼠DG区PV神经元中诱导5-HT5AR不会改变SSRI的作用，这说明DG区PV神经元中该受体的功能在介导慢性SSRIs的延迟抗抑郁反应中至关重要。

Fig4. 5-HT5AR介导对慢性SSRI的行为反应

为了研究PV神经元中cAMP信号的变化如何影响慢性抗抑郁药物治疗后的行为反应，研究人员采用化学遗传学方法，向DG双侧注射1μl rAAV2/hsyn-DIO。在DG双侧注射病毒后21天进行免疫标记证实整个PV神经元存在mCherry蛋白的特异性表达。接着为了测试PV神经元激活对SSRIs行为反应性的影响，小鼠在FST前30分钟注射一次CNO（4 mg/kg，腹腔注射），随后饮用含氟西汀的饮用水18天。结果显示，慢性抗抑郁药治疗导致mCherry和Gi-DREADD-处理过的小鼠的不动性降低。相反，CNO增加了注射Gs小鼠的不动性，验证了慢性SSRI的反应需要抑制PV神经元的观点。

Fig5. 慢性氟西汀治疗对DG区PV神经元中cAMP信号减弱的响应

本次实验结果说明了5-HT5AR通过调节海马PV神经元的活动在介导SSRIs延迟抗抑郁作用中的作用。研究人员发现在DG区PV中，5-HT5A有调节Kv3.1β的功能，并且5-HT5A是PV细胞中唯一表达的5-HTR。另外电生理实验表明，该受体最初是沉默的，只有在慢性SSRI治疗后才能发挥功能。最后证实了SSRI通过在时间上而非空间上协调作用于不同受体和细胞类型来实现抗抑郁反应。

本次实验用到的行为学：

（1）强迫游泳实验（FST）：强迫游泳实验用于反应抑郁症动物的行为绝望，主要用于抗抑郁、镇静以及止痛类药物的药效评价。实验时，将动物置于一个局限的环境中（如水中），动物于该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间后，动物即表现出典型的“不动状态”，反映了一种被称之为“行为绝望状态”。系统可记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数。

实验方法如下：将所有动物分别放入含23℃，20 cm深水的有机玻璃圆筒中，15分钟后，他们被转移至30℃干燥环境30 min（预实验），24小时后小鼠被再次放入有机玻璃圆筒内5 min（正式实验），这期间用摄像机记录，做完一只小鼠后换水，清洁圆筒，强迫游泳结束后的小鼠立即用毛巾擦干。用软件记录悬浮不动时间和次数。

（2）陌生环境摄食抑制(NSFT): 小鼠于新奇环境进食第一口食物花费时间的长短，可用于小鼠对于奖赏反应性以及对周围环境判断力的检测，小鼠进食耗时增加表明小鼠对于奖赏反应性下降，兴趣减低，反应迟钝，对周围环境的判断能力下降，进而模拟人类的抑郁症状。

实验方法如下：在安静空旷的房间内，置于由树脂玻璃制作的旷场中（规格：76.5 cm×76.5 cm×40 cm），旷场中心放置少量食物，试验时从任意的角落将禁食24 h后的小鼠放入旷场内，每只小鼠置于旷场中6 min，整个过程由旷场上方的视频摄像头录入电脑，计算并统计小鼠延迟进食的时间，特别是每只小鼠接近并进食第一口食物的时间。小鼠进食时间的长短反应了其抑郁的程度。

（3）悬尾实验：一种经典而又能快速评价抗抑郁药物、兴奋药物、镇静药物药效的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态。抗抑郁药物、兴奋药物能明显地缩短改变其状态。通过VisuTrack动物行为视频追踪软件可分析此过程。

悬尾实验时用医用胶带将小鼠尾尖部1/3处悬于悬尾装置上，悬挂处于竖直状态，使其头部正对镜头，离地面约30 cm，摄像记录各组小鼠悬尾实验不动时间，持续6 min，取后4 min计算小鼠悬尾不动时间。不动时间判断为小鼠停止挣扎，呈倒悬垂状态，静止不动。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30804492/

  （山东中医药大学中医药与脑科学研究创新团队 陈志彬 供稿）

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