bioRxiv上线新研究：敲除Ptbp-1不会诱导胶质细胞到神经细胞的转分化的直接证据？
神经退行性疾病给当今的老龄化社会带来了沉重的负担，鉴于神经退行性疾病中神经细胞失去功能，内源性胶质细胞转分化为有功能的神经细胞成为了一种可行的治疗策略。
目前大多数转分化的方案是过表达一些促神经元发育的基因或干预胞外信号通路，然而这些方案的成功率并不稳定，有些仅在体外或不成熟的胶质细胞中才能完成，有些仅能部分重编程，或不能产生神经细胞亚型。
近来有文章报道了一种高效转分化的策略，但其文章数据不能充分证明重编程的胶质细胞和神经细胞中的线性关系。开发可靠高效的在体重编程将极大促进神经退行性疾病的细胞治疗。
最近有几篇文献报道在视网膜的穆勒胶质细胞和大脑的星形胶质细胞中敲除Ptbp-1可以实现转分化。Ptbp-1是一种广泛表达在神经细胞和非神经细胞中的RNA结合蛋白及剪切调控蛋白，它可以抑制神经元特异的可变剪切。
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在神经前体细胞中特异性敲除Ptbp-1会导致神经发生提前，而敲除Ptbp-1对体外成纤维细胞和N2a细胞转化为神经元非常重要。而且，有几篇文献表明敲除Ptbp-1对胶质细胞到神经元的转分化也十分重要。
其中一篇文献在视网膜的穆勒胶质细胞中敲除了Ptbp-1，然后细胞迅速转分化为视网膜神经节细胞。同样的研究也报道了Ptbp-1敲除对大脑纹状体中星形胶质细胞转分化为多巴胺能神经元的重要性，转分化后可恢复PD模型小鼠的损伤。第二个研究则研究了在皮层，纹状体和黑质中的星形胶质细胞中敲除Ptbp-1均可诱导重编程为有功能的神经元，其他研究中也报道敲除视网膜穆勒细胞Ptbp-1可重编程为光受体，也可恢复年长小鼠齿状回神经前体细胞的神经细胞功能。
这种简便的方法可以诱导重编程当然是一个很大的进展，但是仍然有一些担忧。首先，这些方法均没有证明在体外胶质细胞的Ptbp-1表达减少。第二，胶质细胞和神经元之间的线性关系被通过基于AAV或转基因GFAP启动子推理出来，但GFAP也表达在部分神经元上。第三，没有直接的胶质细胞-神经元转分化的证据，例如可靠的基因线性分析或scRNA-Seq依赖的轨迹分析。这些担忧需要被证明。
近期，来自约翰霍普金斯医学中心的Seth Blackshaw团队在bioRxiv预印本上发表了关于敲除ptbp-1与胶质细胞到神经细胞转分化的特异性和有效性分析，给出了直接的证据。
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敲除视网膜穆勒细胞中Ptbp-1
不会诱导胶质细胞到神经元的转分化
为了干预视网膜穆勒胶质细胞，作者使用了三种转基因系，GlastCreERT2，可高效诱导穆勒胶质细胞的Cre依赖的重组；Sun1-GFPlox/lox，在Cre激活后靶向核内CAG启动子表达GFP；Ptbp1lox/lox，Cre激活后影响Ptbp-1的表达，通过杂交得到纯合子后使用他莫昔芬诱导，在两周或四周后进行免疫组化分析。
结果表明，纯合子中ptbp-1基本被敲除，同时进行了神经节细胞特异性标志物RBPMS和BRN3B的染色，结果发现两者都没有增加。和以往结果不同的是，作者并没有观察到这些标记物和Ptbp-1敲除的GFP的共定位，GFP同样也没有与圆锥体特异的标志物arrestin以及光受体和双极标志物OTX2的共定位。在敲除Ptbp-1的细胞中没有GFAP的表达，证明Ptbp-1不会诱导胶质细胞激活。
以往结果发现，穆勒胶质细胞转分化为神经节细胞会恢复NMDA损伤后的视功能。在作者的研究中，尽管NMDA治疗导致部分RBPMS阳性的神经节细胞损伤，但仍然没有GFP与RBPMS或BRN3B的共定位，也没有神经节细胞的恢复。
因此，敲除Ptbp-1不会诱导穆勒胶质细胞转分化为神经节细胞，不论是在正常视网膜或是在损伤视网膜中。
图1：敲除视网膜穆勒细胞中Ptbp-1不会诱导胶质细胞到神经元的转分化
敲除大脑星形胶质细胞中Ptbp-1
不会诱导脑内星形胶质细胞到神经元的转分化
同样的方法，构建转基因小鼠后，作者验证了大脑星形胶质细胞是否可以转分化为神经元，主要在大脑的皮层，纹状体及黑质中进行研究。敲除Ptbp-1后，没有观察到GFP和神经元标志物NeuN或HuC/D的共定位，在使用4-OHT诱导损伤2周或8周后均未出现。
以前的研究证明的Ptbp-1敲除可以诱导多巴胺能神经元的标志物产生，但在作者的研究中，Ptbp-1敲除没有诱导TH或DAT的出现，也没有与GFP共定位。
作者近一步探究了Ptbp-1与星形胶质细胞生理功能的关系，结果发现，皮层中没有表达GFP的星形胶质细胞，星胶周围的神经元都具有正常的动作电位。这表明，敲除Ptbp-1不会使星胶产生动作电位，静息电位与未敲除状态一致。上述结果表明，敲除星胶中的Ptbp-1不会诱导神经元样的电生理改变。
图2：敲除大脑星形胶质细胞中Ptbp-1不会诱导脑内星形胶质细胞到神经元的转分化
敲除Ptbp-1仅导致穆勒细胞和星形胶质细胞细微基因表达谱的改变
过往的研究并为定义敲除Ptbp-1后的基因表达谱，作者对敲除Ptbp-1的穆勒细胞和星胶基因表达谱进行了分析，结果发现，与正常细胞相比，Ptbp-1的表达下调，但其他基因表达并没有显著变化。
在穆勒细胞中，Ptbp-2的表达有部分上调，这与Ptbp-1失去功能有关，其他基因的变化也很少，在星形胶质细胞中同样如此。因此，敲除Ptbp-1对穆勒细胞和星胶的基因表达谱影响非常有限。
总 结
在作者的研究中，敲除Ptbp-1不会引起胶质细胞到神经细胞的转分化，并且敲除胶质细胞中的Ptbp-1后，对胶质细胞基因表达谱的改变也非常有限。
Blackshaw S, Hoang T, Kim D W, et al. Ptbp1 deletion does not induce glia-to-neuron conversion in adult mouse retina and brain[J]. bioRxiv, 2021.