今日讲“化”| 如何在制药工艺放大中用好柱层析分离？
柱层析分离技术，在小分子药物的实验室研发和大规模生产中被广泛应用。对于工艺开发人员来说，如何在放大中精确还原研发里的工艺，是一门精密的科学，也是一项具有挑战的艺术。下面我们以硅胶填装柱为例，详细梳理柱层析在工艺放大中的注意要点。
柱层析的研发数据通常包括：样品量、硅胶型号以及量、柱子高度、流动相成分和比例、流速以及产品分离时段。
在放大的过程中，由于研发工艺已经确定，硅胶型号、流动相成分和比例这几个关键因素都是已知，所以分离的选择性和滞留因子也是确定的。但在车间生产的时候，还需要保证硅胶的压实程度，要根据实验室装填硅胶柱的密度等同放大，还要保证填装硅胶的浸润程度，通过流动性出口气泡情况或者通过反向填料确认一致性。换言之，工程师更加注重模拟实验室填装柱的理论塔板数。
一般情况下，工程师会尽量保证柱子高度一致，通过扩大柱子的直径来满足放大的要求，也就是等板高度。可是情况往往不会和想象一致，实际上，车间的柱子的直径经常无法满足放大的系数。这时候，单纯地增加或者减少硅胶的量，以期满足高度的要求，则会在实际生产过程中对于柱层析线速度参数的选择上出现偏差，或者与实验室的情况不一致。
对此，老工程师的经验是时间。由于硅胶，产品以及流动相（洗脱剂）均已经确定，所以影响实验室和车间柱层析放大过程中的质传的关键点就在于时间。因此，可以引入一个接触时间的概念：即在车间放大的柱层析，流动相和吸附在硅胶上的产品之间的接触时间需要和实验室中的保持一致。
网络上能找到很多关于柱层析的注意事项，但是基本都是关于实验室的操作。在车间生产时会遇到一些不一样的问题，有的还很严重问题，甚至实验大牛都可能忽略，例如吸附的热效应。
从柱层析的原理来说，不管运用的是溶解度差异，还是分子间作用力，基本都是吸附-解吸附的过程。所以，这里先重点说说硅胶柱层析分离工艺。
用于填装柱子并分离有机物（非气体）的硅胶，主要利用硅胶的羟基，用硅醇基团作为吸附中心，利用氢键或者分子间诱导力进行吸附，然后在洗脱剂的作用下进行解吸附。不同物质吸附和解吸附的快慢不一样，分离的目的也就达到了。
但是在吸附的过程中，样品跟硅胶的羟基在结合时会放热，尤其是湿法上样阶段，大量样品短时间内吸附，放热量很大。如果用低沸点的洗脱剂，比如二氯甲烷，热效应会很明显。气化的二氯甲烷会造成硅胶柱的压力变化，造成明显的空洞或者断层，大大影响分离。实验室里是这样，在车间放大生产时，热效应加剧，可能直接造成分离失败。所以，在放大生产中要想办法避免或缓解放热带来的影响。
一般车间会使用反应釜或者移动罐进行洗脱液的配制，在这种情况下，可以通过夹套控温，将洗脱液的温度控制在一个较低的合理范围。
热效应导致的压力变化可能引起硅胶柱的空洞或者断层，但这种损害有时并不是那么明显。所以在确定压力和线速度的前提下，应该避免过多的操作柱子，也不要频繁改变洗脱液的压力，防止影响柱子本身的压力。需要注意的是，停柱子的时候——例如配制柱子完成时，停止收样时或者配制洗脱液时——柱子压力往往会出现很大的波动，这时要按照缓冲压力的顺序来操作设备。车间柱层析的常见设备如下图，在图上标注了相应区域的阀门(A、B和C)。
停止柱层析时应该：
1. 先关闭A区域的阀门，这样层析柱下层空间的压力会上升，最终流速归零的时候，则层析柱上下方会保持恒定一致的压力；
2. 然后在关闭阀门B以及C, 这样层析柱就处于一个密封状态。
3. 接下去就是重点了：重新开启柱层析。
所以，常规操作顺序是：打开C和B，然后再打开A。
这种方式在实验室肯定没问题，因为实验室操作相对较快，几乎可以同时在B处加压且打开A处的阀门。车间可能操作相对具有延后性，且此时需要提醒的是，B区域相对于A区域来说，密封性会更差（具有压力表，排空阀之类的多处接口），且洗脱剂从C到B是需要一定的时间，而先打开B处的阀门，有可能会导致B处的压力骤降进而A处的压力或者层析柱内部的压力会反向冲击B处，而导致内部形成断层以及空洞。
所以，在车间内重新启动层析柱时需要另外的流程：
1. 先打开C处阀门，然后打开A处阀门，此时A处以及层析柱内部的压力会从下而上逐步降低，形成洗脱剂的流速。
2. 等待B处压力表逐渐衰减成常压后，打开B处排气阀门；
3. 打开B处阀门进入洗脱剂的补充；
4. 关闭B处排气阀门进行压力的补充并通过控制A阀门控制到合理的流速。
当然上述的流程也可以在停柱子前完成，主要目的还是使压力缓慢从出口泄出，避免从B段进行压力的骤然衰减。
还记得硅胶的吸附原理么？其实就是利用氢键或者分子间诱导力进行吸附，并在洗脱剂的作用下进行解吸附。如果洗脱剂中有水分的存在，就会破坏氢键作用。所以，在放大过程中，我们一般会选择和实验室相同品质的洗脱剂，这样能对洗脱剂含水量有一定控制，以免对分离产生影响。但由于生产中，成本是重要的考量标准，所以车间使用柱层析进行放大时，在一定程度上会使用洗脱剂的回收工艺。
很多人常常只关注组成和比例，忽视其中的水分。这里需要提醒大家，硅胶是具有一定水分的，随着洗脱剂的回收，其中的水分会不断增加，尤其是多次回收后。因此，工程师在考虑洗脱剂回收的时候需要把水分的因素考虑其中，确保工艺的稳定，避免出现柱层析的异常。
这个问题，一直是工艺工程师们想努力克服的重点。其实不管使用干法还是湿法填柱，色谱柱均有一定概率出现空洞或塌陷，比如硅胶的性状，柱子内部的光滑程度，平整度和压力等等因素，都会影响色谱柱。由于相对影响因素较多且内容也较分散，这里就不一一赘述了。
工艺成功放大且稳定一直是工艺工程师们致力的方向。要学会摆脱实验室的思维定势，根据车间实际情况、实际设备、实际工艺，从宏观控制出发，多多注意细节，多多完善工艺。
—— 工艺研究员 高钰，沈晔晨
投稿文章所在领域为化学合成和药物化学类;
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