荧光定量PCR专题:第二期

荧光定量PCR专题:第二期——实验设计

2017-08-18 16:48

小V常常接到科研小清新们的咨询,大家都在苦恼qPCR实验无从下手,或者好不容易做出了结果,又无法判断结果是否真实有效……

其实,解决问题的关键就是一个完美的实验设计!

来来,敲黑板,制作一个完美的实验设计要注意以下几点:

确定实验目标并了解该实验的重要关注点

比如:基因表达谱分析中需要重点关注RNA 质量、逆转录效率、qPCR效率、定量方法及内参基因的选择;而等位基因分型中引物和探针的设计是确保实验成功的关键。

确定扩增产物片段的大小、GC 含量和位置

a.PCR产物大小:一般为80–200 bp,越短的扩增片段受模板完整性差异的影响越小。如果核酸样本出现轻微降解,而靶序列较长,则上游和下游引物在同样的DNA 片段中寻找其互补序列的难度将更大;

b.GC含量:片段应选中等(50%) GC 含量且无明显GC 延伸段的区域

c.位置:对于cDNA 扩增,最好使扩增片段位于转录本的3’端附近。如果RNA 二级结构阻止了某些转录本的全长cDNA 合成,则这些扩增片段受影响的可能性更小。

基因组DNA残留处理

传统的有效规避基因组DNA 污染的方法是设计跨内含子-外显子引物,此方法不但较为复杂而且存在被假基因、可变剪切体污染的风险。那么,从源头上控制基因组DNA污染的方法成为热点,比如Vazyme 逆转录试剂(如图),只需要加入gDNA wiper后42 ℃ 2 min 即可在逆转录反应前轻松消除基因组DNA,得到无基因组污染的cDNA。

引物的特异性、二聚体形成和自折叠

引物除了需要在NCBI Blast验证特异性之外,还需关注引物二聚体的形成。常见的有正向和反向引物的相互作用,但也可能存在正向引物之间或反向引物之间的退火或者单个引物自身的折叠。

使用引物设计软件可预测以上情况的发生。此外,小V为大家推荐个免费的生物信息学工具—AutoDimer,可用来预测引物形成二聚体的风险。工具虽能预测风险,但预实验的验证是必需的。

RNA的质量

a.完整性检测:推荐跑胶或Agilent Bioanalyzer 仪器上评估RNA 的完整性;

b.杂质污染检测:测定A260/A280,A260/A230,确保比值在1.8 和2.0 之间。A260/A280比值低于1.8 表示存在蛋白质污染,会降低反应效率。A260/A230比值有助于评估硫氰酸胍和酚等的残留,它们同样会抑制酶反应。

对照设置

实时荧光定量PCR 所有实验应包括无模板对照(NTC),qRT-PCR 反应还应包括无逆转录酶(NRT对照)。

NTC对照品:包含除DNA 或cDNA 样本外的所有反应组分。可判断由于引物二聚体或PCR 反应产物引起的污染。

NTC对照品:包含除逆转录酶外的所有反应组分(例下图,Vazyme货号R223)。可判断是否存在基因组DNA污染。

采用标准曲线评估效率、灵敏度

标准曲线是评估反应效率的最佳方法:通过构建连续稀释的样本核酸,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。然后以起始核酸拷贝数对数值为X 轴,以Ct 为Y 轴,绘制曲线。曲线的斜率与反应效率之间存在下列关系,效率在90% 至110% 之间认为检测有效。

E(扩增效率)=10^(-1/曲线斜率)-1

标准曲线确定了实时荧光定量PCR 反应可测量的起始模板量范围,而稀释度最高的样本决定了反应的灵敏度。

简而言之,试验设计,只要不忘设计对照组(NTC,NRT),并注意预实验的设置,就一定能够得到可具分析的有效数据。

(0)

相关推荐

  • 荧光定量pcr实验常见问题梳理

    一.无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳,曲线不平滑:标准曲线线性差. 1.扩增产物大小不合适:实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间,如果调整反应的时间有可能扩增500b ...

  • PCR常用的10种策略

    PCR实验包括三大主要的热循环步骤 ,在这个过程中需要多种必要的反应成分 ,通过对PCR的设置做相应的调整,便可以获得一些特殊的实验结果,如产率提高,特异性增强或反应时间缩短等. 常用PCR方法及其核 ...

  • 收藏,收藏!!!辛苦总结荧光定量PCR常见问题打包给IVD从业者!

    常见的荧光定量PCR 问题解答 实时荧光定量技术是什么 20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),其基本原理是在常规PC ...

  • 基因甲基化检测方法有哪些

    探究了宫颈细胞变化与基因甲基化的关系过后,我们要做的就是如何检测出基因甲基化的存在现象.随着科学技术的发展,检验技术也在部断提升.大致可以分为两类:特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析,后者也称 ...

  • MPB:中科院城环所苏建强、朱永官等-功能基因高通量定量方法

    为进一步提高<微生物组实验手册>稿件质量,本项目新增大众评审环节.文章在通过同行评审后,采用公众号推送方式分享全文,任何人均可在线提交修改意见.公众号格式显示略有问题,建议电脑端点击文末阅 ...

  • 普通PCR技术和数字PCR技术,什么区别?

    IVD资讯 116篇原创内容 公众号 PCR技术自问世以来,在遗传病.病原体.癌基因等分子诊断领域和法医鉴定等方面发挥了巨大作用.按照PCR技术的演进,人们习惯性将PCR技术划分为三代:普通PCR技术 ...

  • 荧光定量小课堂丨这么实用的曲线图分析法怎么可以不学!——熔解曲线分析

    说起曲线图,一直都是小编心中的痛.因为每次看到它们,小编就会想起学生时代的噩梦--函数. 就是这种"恐怖"的图 从小学开始被各种函数虐得体无完肤,譬如:常年保持"抛物线& ...

  • 实时荧光定量PCR实验技术原理

    实时荧光定量PCR实验原理:将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性.低温复性.适温延伸的热循环,并遵循聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游 ...

  • 荧光定量PCR技术在食品检测领域中应用

    随着生活水平提高,人们对食品质量要求越来越高,而目前广泛应用物理.化学.仪器等检测食品方法,由于存在某些局限,已不能满足现代食品安全检测需要.随着生物技术发展,尤其是自从发明聚合酶链式反应(polym ...

  • 实时荧光定量PCR检测操作方法

    实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法.通过内参或者外参法对待测样品中的 ...

  • 荧光定量PCR检测实验流程

    荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的最普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓 ...

  • 聊一聊荧光定量PCR中的四个高频词

    现如今,实时荧光定量PCR技术(以下简称qPCR)在传染病检测.动物疫控.药物基因组学和生殖遗传等等应用领域已经成为一颗耀眼的明星,这些应用领域都是借助qPCR检测核酸靶标进行定性或者定量实验.现实应 ...

  • 【金钥匙】荧光定量PCR要点大解析

    聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能最强大的技术之一.实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成,常用于定量样本中的 DNA 或RNA.今天小析姐就和大家聊一聊荧光定量PCR ...

  • 荧光定量FAQ专题: 第(一)期

    2017-08-17 14:12 充分的准备是实验成功的关键,那么,qPCR实验需要提前做好哪些了解呢? 1.试剂的储存条件 市面上大多数qPCR试剂推荐 - 20 ℃ 避光长期储存. Vazyme的 ...

  • 荧光定量PCR,你是如何加样的?

    荧光定量PCR是科研过程中不可缺少的一种实验手段.番茄君还记得自己第一次做荧光定量PCR时,面对着96孔板甚至是384孔板时,十分紧张.即使提前很久计划好了该怎么加样,但是当看到密密麻麻的孔时,还是生 ...