制备扁豆凝集素填料的分离纯化
制备扁豆凝集素填料的分离纯化
扁豆凝集素的分离纯化
2.1试验材料 扁豆种子，无水乙醚，0.15 mol/L NaCl,0.02 mol/L Tris-HCl,硫酸铵，聚乙二醇， DEAE-52， Sephacryl S-300、CMFastFlow、SephadexG-25，丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺，链霉蛋白酶(pronase E)，牛血清白蛋白(BSA)，对二甲基氨基苯甲醛(DAB)、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)。
试验方法
2.2.1 扁豆凝集素粗品的制备 取扁豆种子100g，去皮磨成粉末，用无水乙醚(1：4，v:v)于4℃浸泡脱脂2次。然后，用含0.15 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCI，pH 7.8缓冲液(1：4，v:v)在4℃下浸提两次每次24小时。 提取液经离心(4℃，10000rpm，30 min)后，弃去沉淀，上清液采用硫酸铵分段盐折法，取饱和度为40％～80％的沉淀，将沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl，pH 7．8缓冲液中得到相应的粗品。[4] 2.2.2 扁豆凝集素的纯化 粗品4℃下充分透析除盐，然后上经0.02mol/L Tris-HCI,pH 7.8缓冲液平衡的DEAE-52阴离子交换柱，充分淋洗后，换用含0.5mol/LNacl的相同缓冲液进行离子线性梯度洗脱，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，经紫外和凝集兔红细胞活性检测后，收集活性部分。此活性部分对0.02 mol/L NaAc-HAc,pH 5.0缓冲液充分透析，然后上用相同缓冲液平衡的CM Fast Flow阳离子交换柱，充分淋洗后，换用含0.5 mol/LNaCl的相同缓冲液进行离子线性梯度洗脱，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，经紫外和凝集兔红细胞活性检测后，收集活性部分。此活性部分用聚乙二醇20 000浓缩后，对含0．15 mol/L NaCl的0．02mol/L Tris-HCl，pH 7.8缓冲液充分透析，并用相同缓冲液平衡Sephacryl S-300柱，然后在FPLC上进行分子筛层析纯化，分部收集，流速为l ml/min，3 ml/管，经紫外和凝集兔红细胞活性检测后,收集活性部分,再过Sephadex G-25柱除盐后得扁豆凝集素纯品。
扁豆凝集素的性质研究
3.1 试验材料 扁豆凝集素提取液，考马斯亮蓝，高碘酸-Schiff 试剂，生理盐水，PBS缓冲液，2 ％兔血细胞悬液，缓冲系统，金属离子，乳糖，蔗糖，麦芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸馏水溶液，大肠杆菌，产气杆菌等PDA培养平板
3.2 试验方法 3.2.1 扁豆凝集素的基本性质检测 3.2.1.1 纯度鉴定和糖蛋白的确定 采用柱状圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝和高碘酸-Schiff 试剂分别染色，根据凝胶呈现色带的情况确定扁豆凝集素的纯度和是否是糖蛋白。 3.2.1.2 扁豆凝集素的等电点测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电聚焦发测定其等电点，所用凝胶浓度为7%，两性电解质为ph3.0-10.0的Ampholin，其较后浓度为1.5%左右，上下电极分别是5%的磷酸而后5%的乙二胺溶液。[5] 3.2.1.3 分子量的测定 采用Bio-Gelp 100凝胶色层法，以牛血清蛋白（68000）、卵清蛋白（45000）、胃蛋白酶或乳球蛋白（35000）、和糜蛋白酶原（24500）等为标准蛋白，用1 molNaCl溶液作为平衡也和洗脱液，在ø1.2×100cm玻璃柱内进行。[6] 3.2.1.4 扁豆凝集素的活力测定 取96孔微型凝血板，在每一个孔内滴入25μl0.9％生理盐水。取25μl硫酸铵沉淀样品，进行系列倍比稀释(从前一孔吸取25μl液体，放入下一孔内，充分混合后25μl液体放入下一孔内，如此操作至倒数第二个孔)，留下每一排的较后一孔，作为对照。在每一个孔内滴入25 u1 2％兔血红细胞，室温下放置30 min后观察。[7] 3.2.2 扁豆凝集素的热稳定性测定 在96孔V型血凝板上加4 5μl凝集素溶液与等量PBS缓冲液倍比稀释后,放在温度为30℃、40℃、 50℃、60℃、 70℃、 80 ℃、 90 ℃水浴中保温5min后取出，待其冷却至室温，加入等量的 2 ％兔血细胞悬液，振匀。1h 后，用显微镜进行检测。血凝活力以凝集素较大稀释倍数(以2 n表示)，以PBS作空白对照。比较凝集活性。
3.2.3 碱稳定性测定 在凝血性试验的基础上，选定兔红血球配制成2％(体积浓度)生理盐水重悬液，分别使用以下缓冲液为溶剂配制浓度为1-5 mg/mL的凝集素溶液： (1)NaAc--HAc缓冲液(pH 3.7-5.8) (2)NaH2P04—Na2HP04缓冲液(pH 6.2-7.8) (3)Tris—Hcl缓冲液(pH 8.23-9.10) (4)Na2C03--NaHC03缓冲液(pH 9.5-10.83) (5)Na2HP04一NaOH缓冲液(pH 11.2-11.9) (6)KCl--NaOH缓冲液(pH 12.2-13.0) (7)0.09%生理盐水 配制好的溶液在25℃水浴锅保温30min后，分别加入融含25μl血球缓冲液和50μl此2％(体积浓度)红血球重悬液的“V”形板孔中，振荡1min，室温下静置1.5-2h，观察凝血结果。[9] 3.2.4 金属离子结合特性试验 将离子交换层析得到的样品装入透析袋内，放入20 mm EDTA溶液中24 h，以螯合凝集素中的金属离子。然后用0.9％NaC!溶液充分透析去除EDTA。取透析后的样品进行倍比稀释，加入25 μl 2％兔红血细胞悬液。取25μl浓度为10mm的10个过渡金属离子和一种非金属离子，即Ba2+、K2+ 、Za2+、Li2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Al3+和Mn2+等lO个金属离子和NH+4离子放入V型血凝孔内。另取25μl 0.09％NaCl溶液作为对照。静置1 h后观察现象并读取血凝孔数。[10] 3.2.5 扁豆凝集素的糖抑特性试验 用0.9％生理盐水倍比稀释离子交换层析得到的样品后，在每一个稀释孔内加入依次分别加入25μl 50 mM，100 mM和200 mM浓度的乳糖，蔗糖，麦芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸馏水溶液。随后在每一个稀释孔内加入25μl 2％兔红血细胞悬液。静置30 min后观察凝血现象并读取凝血孔数。
小扁豆凝集素-琼脂糖凝胶
Acitavated CH Sepharose 4B
Acitavated CH-琼脂糖凝4B
Calmodulin Sepharose4B
钙调素-琼脂糖凝4B
Lentil lectin Sepharose4B
小扁豆凝集素-琼脂糖凝胶4B
双花扁豆凝集素(DBA)
黑皮扁豆凝集素
FITC-LCA 绿色荧光标记小扁豆凝集素
荧光探针标记的扁豆凝集素
扁豆凝集素凝胶
辣根过氧化物酶标记的刀豆凝集素(HRP-ConA)
辣根过氧化物酶标记欧曼陀罗凝集素((HRP-DSA)
辣根过氧化物酶标记麦胚凝集素(HRP-WGA)
辣根过氧化物酶标记小扁豆凝集素(HRP-LCA)
血清α1抗胰蛋白酶小扁豆凝集素
刀豆凝集素单克隆抗体
菜豆凝集素(PHA)单克隆抗体
美洲商陆(PWM)单克隆抗体
花生凝集素(PNA)单克隆抗体
扁豆凝集素(LcA)单克隆抗体
流脑多糖协同扁豆凝集素
扁豆凝集素十六烷基季铵盐包裹磁性纳米颗粒
小扁豆凝集素(LCA)的琼脂糖微量离心柱分离AFP-L3
改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体纳米微球
红藻凝集素GRFT
蓝藻凝集素CVN
香蕉凝集素H84
wyf 03.30