【人物与科研】广州中医药大学刘芳研究员课题组：二氢喹啉的合成及其作为羟基自由基荧光探针骨架的应用
∂导语
刘芳研究员课题组简介
刘芳研究员课题组成立于2018年，隶属于广州中医药大学热带医学研究所（现青蒿研究中心）。课题组现有硕士研究生9人。研究方向包括：发展新的化学反应、小分子以及纳米探针技术用于生物分子的检测；构建新的化学工具用于药物靶点筛查、药物的光学示踪及药理研究等。近期在光学探针构建及药物和生物分子检测（Chem. Commun. 2020, 56, 4432-4435; Org. Biomol. Chem. 2020, 18, 2468-2474; Sensors & Actuators, B: Chemical. 2020, 304, 127392; Dyes Pigments. 2020, 173, 107915; Anal. Bioanal. Chem., 2019, 411, 8103-8111; Talanta 2019, 195, 152-157）领域取得一定进展。
刘芳研究员简介
刘芳，广州中医药大学研究员，博士研究生导师。2010年本/硕毕业于兰州大学，2014年博士毕业于新加坡南洋理工大学，2014年至2017年先后在德国乌尔姆大学有机化学所、美国斯坦福大学化学系从事博士后研究。2017年12月入职广州中医药大学。主要研究兴趣：新型小分子/纳米探针的制备及其在生物分析上的应用。近年来，以第一作者或通讯作者在Angew. Chem. Int. Ed.；Org. Lett.；Chem. Commun.等国际著名期刊上发表SCI论文多篇。担任Chem. Commun.; Anal. Chem.; Bioconjugate Chem.; Dyes Pigments 等多个SCI期刊的审稿工作。任中国化学快报 Chinese Chemical Letters 青年编委; Frontiers in Chemistry客座副主编。
前沿科研成果
二氢喹啉的合成及其作为羟基自由基荧光探针骨架的应用
课题组发现在水相条件下，用NaOH作为碱，芳族乙酰基化合物可与3-甲酰基-1-甲基喹啉反应形成加成产物二氢喹啉, 而不是形成缩合产物。更重要的是，这种二氢喹啉可以作为化学探针，通过荧光开启方式实现·OH的定量检测，且具有较高的选择性和灵敏度（方案1）。
方案1：二氢喹啉的制备方法及其在·OH检测中的应用
（来源：Org. Lett.）
首先，作者采用2-乙酰基萘1a作为模型底物，与3-甲酰基-1-甲基喹啉2在H2O/乙醇（1:1）中进行反应，对催化剂、反应温度、反应时间等条件进行优化。最终确定温和的反应条件为：2倍当量的NaOH作催化剂，室温下反应5小时。在该条件下，作者以90％的分离产率得到目标二氢喹啉3a。增加碱的量将导致产率降低，延长反应时间可以稍微提高反应产率，但是更长的反应时间（例如20小时）会导致副产物，使分离产率降低。升高反应温度，也会呈现类似的趋势。在最佳反应条件下，作者研究了多种芳族乙酰基底物的反应情况（方案2）。
方案2：二氢喹啉衍生物的合成及产率。反应条件：化合物1（0.2 mmol），化合物2 （0.24 mmol），氢氧化钠（2 eq to 1）在4 mL H2O/ethanol (1:1) 混合溶液中，室温搅拌反应5小时。所示为分离产率，a反应20 h的产率。
（来源：Org. Lett.）
接着，作者测试了所得二氢喹啉对·OH的检测能力。如测试溶液的颜色和荧光变化所示，所有测试的化合物均可与·OH反应。对氢的捕获被认为是·OH介导的重要氧化途径，这也是二氢喹啉被·OH氧化的主要机理。当研究带有取代基的乙酰基萘的二氢喹啉产物（3a-3g）时，作者发现取代基推拉电子效应可以极大地影响其氧化产物（3a-pr至3g-pr）的光物理性质。简而言之，给电子取代基可导致荧光发生明显的红移，而吸电子基团可导致蓝移（图1A和1B）。
图1: 二氢喹啉的光物理特性
（来源：Org. Lett.）
由于3c具有良好的光物理性能，作者系统地评估了其检测·OH的能力。如图2A所示，仅与H2O2孵育不会导致荧光变化，当添加Fe2+时，荧光急剧增强。3c对·OH具有较高的敏感性，在低微摩尔浓度的·OH反应后荧光明显增强（图2B和2C）。荧光增强表现出·OH浓度依赖性，表明3c可用于定量分析·OH。作者进一步证实3c可以选择性地响应·OH即使在高于·OH的浓度下，几种常见的活性氧和活性氮也不会导致探针的荧光变化（图2D）。此外，在·OH淬灭剂DMSO存在下，荧光强度显著降低，进一步证实了3c对·OH的选择性。
图2: 二氢喹啉探针3c对·OH的体外检测
（来源：Org. Lett.）
同时，作者在活细胞中进行·OH检测，EDTA-Fe2+/H2O2芬顿系统被作为温和的试剂在活细胞中生成·OH。如图3所示，经过3c 和DTA-Fe2+/H2O2处理的HeLa细胞出现亮绿色荧光，相反，在添加H2O2之前，3c和EDTA-Fe2+处理的细胞仅显示背景水平的绿色荧光。与商品化溶酶体红色荧光探针共孵育后，3c的亚细胞定位显示其主要存在于细胞溶酶体（图4）。通过Image J定量分析了3c和溶酶体探针的共定位，皮尔逊相关系数（PCC）为0.87，表明3c具有明显的溶酶体定位（图4F）。
图3: 二氢喹啉探针3c在活细胞中对·OH的荧光成像。
（来源：Org. Lett.）
图4: 二氢喹啉探针3c与溶酶体红色荧光探针共定位
（来源：Org. Lett.）
总结：刘芳研究员课题组通过乙酰基底物和3-甲酰基-1-甲基喹啉之间的加成反应，开发了一种温和而简便的制备二氢喹啉的方法，并首次表明这类二氢喹啉可以作为荧光探针用于·OH的检测。并且，氧化产物的荧光性质可通过取代基的推拉电子效应或增大共轭体系进行调整。此外，这种合成方法还可用于构建基于化学反应的比率式荧光探针或近红外荧光探针。
该研究成果近期发表在Org. Lett.（2020, DOI: 10.1021/acs.orglett.0c03852）上，广州中医药大学2018级硕士研究生吴亚兰和黄文怡为文章的共同一作，刘芳和邓涛研究员为文章的共同通讯作者。该文章得到了中国国家自然科学基金，广东省教育厅和广州中医药大学等基金项目的支持。