病理文汇 | 快速免疫组织化学在术中冰冻诊断中的应用研究
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文丨 南方医科大学南方医院病理科 黎兵兵
摘要
术中冰冻病理诊断为了临床通过了快速而准确的诊断，而术中冰冻病理诊断又是病理诊断中的难点，有时候术中冰冻诊断与术后石蜡切片和常规免疫组化有一定的漏诊及误诊。虽然冰冻诊断结果与医生经验、水平等有相关性，但是如何提高冰冻诊断的准确率一直是我们病理工作者追求的目标，因为术中冰冻诊断结果往往关系到手术方案最后的确定。因此我们将快速免疫组织化学应用于术中冰冻诊断中，探讨其应用研究及进展。
在实际病理诊断工作中，只通过石蜡 HE 切片，有的时候难以做出准确的诊断和判断肿瘤的良、恶性等，由此可想在术中冰冻诊断中更是如此，往往我们在术中冰冻诊断中 30 分钟就需要做出诊断，那就增加了诊断的难度，也提高了一定的漏诊及误诊率。而在常规石蜡切片中我们往往需要做免疫组化进行辅助诊断，但是这个过程需要几天，因此不能为临床做出既快又好的诊断。近些年来，免疫组织化学技术广泛应用于常规石蜡切片中，且大大提高了病理诊断的准确率，而在术中冰冻诊断中应用较少，因此探讨其在冰冻诊断中的应用研究及其可行性。
快速免疫组织化学技术（IHC）
IHC是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用标记好的特异性抗原或抗体作为检测试剂，来检查被检测标本中的相应的抗体或抗原的一种方法。
快速免疫组织化学技术在病理诊断中的应用
目前免疫组织化学在病理诊断中主要体现为以下几方面的应用[1、2]，如对肿瘤良恶性的判断、确定肿瘤的分期、肿瘤的分类及分型、确定肿瘤的来源、对“未分化”恶性肿瘤的分类、及时准确的发现微小转移灶、预测治疗反应和预后等。
快速免疫组织化学技术在病理诊断中存在的问题及局限性
① 在免疫组织化学操作处理过程中存在一定的脱片，脱片指的是载玻片上的组织切片因粘附不牢而脱落，造成免疫组化诊断过程终止，严重影响诊断工作的效率[3]。
② 假阳性[1、3]，即为阳性信号定位不准确，包括着色不匀、背景着色、边缘效应，某些组织特定成分也能导致假阳性结果。假阳性原因分析多种多样，可以是抗体稀释度过高、抗体不纯或者抗体特异性不强，发生交叉反应，内源性过氧化物酶丰富、切片中坏死组织多、切片染色过程中干燥等。
③ 假阴性[1、3]，是指抗体所标记的切片均呈阴性，本应该出现阳性的也呈阴性，不能反应真实情况。其原因分析包括抗原修复方法不对、固定时间过长、烤片温度过高、固定液不合适、孵化时间过短、抗体浓度过低或失效等，导致抗原丢失。
④ 局限性，在病理诊断中，需要的标记物常需要高准确性、灵敏性以及特异性的特点，但这只是理想的状态，在实际中往往难以做的。免疫组织化学在病理诊断中往往没有哪一种抗体，其特异性、敏感性都很高，也没有哪一种抗体只在某一种肿瘤中特异性表达，因此往往需要结合多种抗体才能做出疾病的诊断。
快速免疫组织化学与常规免疫组织化学
常规免疫组织化学：
① 常规石蜡包埋后，切成 3-5μm 的切片，将切片放在恒温箱烤片 60℃ 60min；
② 再将切片进行脱蜡、水化处理；
③ 然后使用浓度为 3% 的双氧水在室温条件下孵育10min，并使用蒸馏水进行洗涤 3 次，每次 3 min；
④ 高压锅进行抗原修复，抗原修复时间为 2 min（上汽2min）；
⑤ 自然冷却后（或缓慢降温，小水冲洗高压锅，勿迅速降温），使用 PBS 进行洗涤 3 次，每次 3 min；
⑥ 滴加一抗进行孵育37℃ 60 min 或者 4℃ 过夜（4℃ 过夜后需要在 37℃ 复温 45min）；
⑦ PBS 进行洗涤 3 次，每次 3 min；
⑧ 滴加二抗，室温或 37℃ 孵育 30 min；
⑨ PBS 洗涤3次，每次 3 min；
⑩ DAB 显色 5-10 min；
⑪ 用蒸馏水进行冲洗 10 min；
⑫ 苏木素复染，脱水，封片。
常规免疫组织化学基本过程如上所述，虽然不同的方法有一定的差异，具体使用方法以各种抗体的使用说明书为准，采用的方法有 SP法、PAP法、ABC法、LSAB法等，如果通过这个方法进行免疫组织化学染色的话，往往需要 2 天左右才能得到结果。
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快速免疫组织化学[4、8]
①冷冻切片冷甲醇(4℃)固定 1 min，自然晾干 15 s，强力 PBS 冲洗 1 次 10 s；
②加即用型一抗体37℃孵育 5 min，PBS冲洗3次，每次 10 s；
③加即用型二抗 37℃ 孵育 5 min，PBS 冲洗 3 次，每次 10 s；
④DAB 显色剂 37℃ 1 min，蒸馏水冲洗 1 次 10 s；
⑤苏木精复染 15 s，返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
快速免疫组织化学采用的是一步法，相对于常规免疫组织化学来说，其采用的为两步法或者三步法，因此快速免疫组织化学相对来说节省时间，操作简便。虽然不同抗体操作有一定的差异，但是基本操作步骤相似如上，但是具体操作以各种抗体的使用说明书为准。采用的方法有 EPOS法[4、7]、RAMOS法[7]、Maxvision法[5、8]、EnVision法[9]、EliVisoin法[10]等，如果使用快速免疫组织化学技术的话，一般只需要 30-40 分钟就可以得到结果。
快速免疫组织化学的优点和局限性
快速免疫组织化学对于术中冰冻 HE 切片诊断来说，准确性提高了，虽然时间有可能有所延长，但是还是在可接受范围，一般冰冻诊断大约 30 min，而快速免疫组织化学来说也只需要 30-60 min。而对于常规免疫组织化学来说，有一致性，甚至有某些抗体在检测中超过常规IHC。因为冰冻切片保持了组织中原有抗原的活性或者防止了其一定的丢失，而石蜡切片进行 IHC 则需要进行抗原修复，有些抗原还有可能丢失，所以有可能出现这种情况。张永生等[5]在采用 MaxVision 快速免疫组化法检测 118 例前列腺穿刺组织冰冻切片中 P40、34βE12、P504s 的表达，并与常规免疫组化结果进行分析发现没有统计学意义，两者高度一致性，张剑利等[11]在对 20 例喉鳞状细胞癌患者的 25 个颈淋巴结进行研究分析及漆兰等[8]在对乳腺癌中检得 67 枚 SLN 进行术中冰冻切片免疫组织化学检测得出相同结论，刘西林等[12]在对冰冻切片甲状腺乳头状癌（PTC）中 CK19、HBME-1、Galectin-3 的检测中也得出上述结论，且发现CK19在冰冻切片快速 IHC 中显色强度好于石蜡切片常规 IHC。快速 IHC 也是一种免疫组织化学技术，因此也有上述免疫组织化学的优缺点，但是也有其特殊的地方，就是快速 IHC 不需要进行抗原修复，但是也存在不足，就是有些用于快速 IHC 的抗体没有这种试剂，价格也比较昂贵。
小结和展望
近年来，免疫组织化学（IHC）广泛应用于病理诊断工作中，但是主要运用于石蜡切片中，而在冰冻诊断中很少使用，但是随着各种文献报道，各位病理工作者都在这方面努力，因为术中冰冻诊断结果的准确与否关系到手术的方案，与患者切身利益息息相关，在这方面的发展趋势刻不容缓，而且从这方面的研究报道来看，快速 IHC 可以提高术中冰冻诊断准确性，相对于常规 IHC 来说具有一致性，也存在于某些方面优于常规 IHC，但是也存在不足，价格昂贵，有些试剂不能用于冰冻诊断，但是随着科技的发展和各位病理工作者的共同努力，相信这些问题在今后一定可以解决，而对于快速 IHC 在术中冰冻诊断中的应用及其可行性，还需要我们进一步的研究和探讨。
主要参考书目、文献：
[1]张卫琴.免疫组化技术在病理诊断中的应用[J].安徽医药,2012,(11):1700-1702.
[2]谢坤鹏.免疫组化技术在病理诊断中的应用研究[J].中外女性健康研究,2015,(12):79,35.
[3]李新忠.免疫组织化学技术在肿瘤病理诊断中的应用及其存在问题研究[J].医药前沿,2014,(19):97-98.
[4]黄文波,孙永红.冰冻切片快速免疫组织化学染色[J].潍坊医学院学报,2004,(1):11-11.
[5]张永生,张立平,刘西林,等.快速免疫组化技术在前列腺穿刺组织冰冻切片诊断中的应用[J].中国基层医药,2015,(11):1700-1703.
[6]刘西林,杨平玲,张永生,等.快速免疫组织化学技术在甲状腺肿瘤术中冷冻诊断中的应用[J].肿瘤研究与临床,2011,(12):810-813.
[7]谢丽微,周伶俐,王宗敏.冷冻切片免疫组织化学技术的应用体会[J].临床与实验病理学杂志,2007,(1):91-92.
[8]漆兰.术中冰冻及快速免疫组化检测在乳腺癌前哨淋巴结诊断中的应用分析[J].江西医药,2015,(6):585-587.
[9]Kammerer U,Kapp M,Gassel AM,et al．A new rapid immunohistochemical staining technique using the EnVision antibody complex．J Histochem Cytochem,2001,49：623—630.
[10]何沁,徐华,邵牧民,等．乳腺肿瘤冷冻切片诊断中快速EliVision技术的价值.临床与实验病理学杂志,2007,23：553-556.
[11]张剑利,王跃建,陈伟雄,等.淋巴结快速免疫组织化学法检测喉癌的微转移——附25份淋巴结检测报告[J].新医学,2009,(7):450-452,封3.
[12]刘西林,杨平玲,张永生,等.快速免疫组织化学技术在甲状腺肿瘤术中冷冻诊断中的应用[J].肿瘤研究与临床,2011,(12):810-813.