【衡道丨干货】快速组织处理技术：一种使用水杨酸甲酯的新方法

组织处理是组织活检术后的一项重要组织技术。它包括以不同浓度的各种化学物质通过活检组织，以使组织易于切片。这包括脱水，清除和渗透。脱水溶液通常是醇基溶液，用来从组织标本中除去水和固定剂（如福尔马林）。然后将组织置于二甲苯中，二甲苯是一种清除剂，通过去除酒精使组织易于接受蜡浸渍。接下来是渗透——用支持介质渗透组织并包埋——将组织样本定向在支持介质上并使其固化。

整个过程需要2-3个工作日，然后才能对显微镜下的切片进行诊断。

常用的组织处理方法有常规手工法、快速手工法和微波法。常规手工法是组织病理学实验室中常用的一种经过时间检验的方法。可靠性和经济性是该方法的积极因素。这种方法的缺点是周转时间为21-24小时，且暴露于二甲苯和福尔马林等有害化学物质中。

快速手工组织处理方法和最近的微波方法缩短了处理时间，但并没有减少高成本和有害化学物质的暴露。

在本研究中，使用水杨酸甲酯代替常规使用的二甲苯进行清除步骤。水杨酸甲酯（冬青油）是一种有机酯，可以自然（冬青植物–刺槐和桦木）获得，也可以通过将水杨酸与甲醇酯化而获得。

它是一种优良的清除剂，用于研究胚胎、昆虫和植物的内部部分。与二甲苯相比，水杨酸甲酯的无毒特性和快速清除特性促使将其纳入研究。

本研究的目的是缩短周转时间，并在组织处理中使用替代的无毒化学物质，这也是具有成本效益的。进行这项研究是为了开发一种使用水杨酸甲酯作为清除剂的快速组织处理方法，并将其与常规组织处理技术在染色质量、收缩率和成本方面进行比较。

材料和方法

本研究共包含了70个组织标本，其中只有3个为硬组织标本（2个骨骼和1个牙齿组织）。每个标本都分成两部分，一部分组织采用常规处理技术（RoPT），另一部分采用快速处理技术（RaPT）。

两种技术所用的时间和化学药品见表1和表2。

表1 快速组织处理的步骤

表2 用二甲苯进行常规组织处理的步骤

两种技术处理前后测量组织样本尺寸，检查收缩率。

表3 在大体标本水平上组织收缩的比较

图1

(a) 采用快速处理技术处理后对组织的测量

(b) 采用快速处理技术处理前对组织的测量

图2

(a) 采用常规处理技术处理前对组织的测量

(b) 采用常规处理技术处理后对组织的测量

所有切片用苏木精和伊红染色观察组织学细节。组织染色质量分级1-3级——1级为优、2级为良、3级为满意。该评分系统是Panja等人的改良版。当细胞和组织结构清晰，染色对比度好时，评分1。评分2分表示组织染色、对比良好，可诊断。当组织染色不充分或不均匀且缺乏细节时，评分为3分。

图3

(a) 采用常规处理技术处理的组织染色质量

(b) 采用快速处理技术处理的组织染色质量

观察上皮细胞和结缔组织的细胞核和细胞质的染色质量，并分别对两种方法处理的标本进行评分。

对切片进行形态分析，观察微观水平上的收缩差异。从每组标本中选取5个最具代表性的区域进行图像采集。使用三目研究显微镜上的三芯片CCD摄像机，以×40物镜进行成像，总放大倍数为400。所选区域包括具有明显细胞和细胞核轮廓的典型细胞。

随机选取50个细胞(5个不同高倍镜视野下各10个细胞)，分别测量平均细胞面积、平均核面积和核质比。使用精密的计算机辅助形态测量软件进行测量，测量值传输并存储在计算机中。跟踪周长时，该软件会自动以平方微米为单位计算细胞和核面积。“设置比例”是在软件中完成的，该软件将默认像素测量转换为微米。

图4 利用软件进行标记和测量

图5 细胞和细胞核的测量标记

评分和评估由四名合格的观察员进行，以消除观察者之间和内部的偏差，因为大多数评价标准是主观的。

所得数据进行列表，采用Welch’s不等方差t检验进行统计分析，并采用统计软件包进行均值计算。

比较两种技术中化学品的成本(以印度卢比计)，以确定哪种技术具有成本效益。

图6 快速和常规组织处理(60个样本)的成本比较

结果

与常规处理2天相比，快速处理6小时染色。本研究比较了快速处理和常规处理两种处理技术。

1. 染色质量

表4 关于伪影、褶皱和染色的组织总体质量

2. 上皮组织核质分化的清晰度

表5 上皮组织细胞核染色质量

表6 上皮组织细胞质染色质量

3. 纤维组织核质分化的清晰度

表7 纤维组织（包括血管、腺组织、炎性细胞、类骨质成分、肌肉、神经）细胞核染色质量

表8 纤维组织（包括血管、腺组织、炎性细胞、类骨质成分、肌肉、神经）细胞质染色质量

所有参数的P值均无统计学意义

4. 两种处理方法的总水平组织收缩比较，差异有统计学意义[表3]；而细胞水平收缩无显著性差异。

表9 细胞水平上组织收缩的比较

讨论

常规处理需要2-3个工作日才能将诊断结果送达患者。目前可用的快速处理至少需要16-48小时才能完成。

组织处理的自动化可以通过延长实验室的工作时间来加速这一过程，但它需要持续的电力供应，也是一件昂贵的事情。

病理诊断在很大程度上依赖于福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。本研究提出了一种快速处理技术(RaPT)[表1]，并与常规处理技术(RoPT)进行了比较。快速法处理后的组织与常规法处理后的组织在便于切片、条带率高、染色效果好、染色持久(6-12个月)、染色质量满意等方面具有可比性。

在这些技术处理的软组织和硬组织中都观察到这些特性。此外，对脱钙组织进行观察和比较。但由于硬组织的样本量较少，故硬组织未进行统计学比较。

乙醇脱水后用水杨酸甲酯作清洗剂，可提高该工艺的效率。本研究利用组织样本在短时间内使根组织透明以研究根管形态的特性。

水杨酸甲酯相对于二甲苯的优点是低毒。然而，它们强烈的刺鼻气味需要良好的实验室通风。它使组织收缩和硬化最小化，组织可以无限期地保留在其中而不受损害。

比较了RaPT和RoPT处理的组织和切片在伪影、皱褶和染色方面的一般质量，得出P = 0.24，这在统计学上不显著[表4]。

上皮组织和结缔组织的细胞核和细胞质染色比较P值分别为0.30、0.18、0.34和0.26[表5 - 8]。结果被认为在统计学上不显著，这表明两种处理技术的结果是可比较的。因此，RaPT技术的结果是令人满意的。

本研究中提出的快速处理技术有助于以可承受的成本实现与常规处理技术相媲美的结果。该研究可以减少报告的等待时间，对病理实验室是有益的，对早期诊断和早期治疗的患者也是有益的。

版权声明：本公众号发布所有内容，版权均属衡道医学病理诊断中心及相关版权方所有。未经允许，禁止任何形式的转载；如需转载请提前联系本公众号，并在使用时注明「来源：衡道病理」。