文献解读 | 15+高分文章教你如何只用公共数据库研究RNA修饰
m6A, m1A，选择性多聚腺苷酸化（APA）和腺苷到肌苷的RNA编辑（A-I），这四种常见的RNA腺苷修饰，主要是由“writer”酶介导的，构成免疫反应和肿瘤发生的表观遗传调控的关键机制。
然而，这些“writer”在肿瘤微环境(TME)、药物敏感性、靶向治疗和免疫治疗中的相互作用和潜在作用仍不清楚。下面我们就来看一篇在结直肠癌里面的研究。
这篇文章是：Cross-talk of four types of RNA modification writers defines tumor microenvironment and pharmacogenomic landscape in colorectal cancer（四种RNA修饰writers的交互定义了结直肠癌的肿瘤微环境和药物基因组景观）。发表于2021年的Molecular Cancer，IF是15.302，妥妥的高分文章啊。
研究思路
本研究系统地描述了26个RNA修饰“writer”在结直肠癌(CRC)中的mRNA表达和基因改变，并评估了他们在8个数据集1697个CRC样本中的表达模式。使用无监督聚类方法将样本划分为两种RNA修饰“writer”的表达模式。
随后，构建基于负责RNA修饰模式的差异表达基因(DEGs)的RNA修饰“writer”评分(WM_Score)模型，以量化个体肿瘤的RNA修饰相关亚型。
此外，还对WM_Score与TME特征、共识分子亚型(CMSs)、临床特征、转录和转录后调控、药物反应和免疫治疗疗效进行了关联分析。本文的工作流程如下figure1 S所示:
结果证实RNA修饰“writer”的多层改变与CRC患者生存和TME细胞浸润特征相关。发现WM_Score-high和-low两种不同的RNA修饰模式。
WM_Score-high组与较差的患者总生存和抑制免疫细胞的浸润相关，如M2巨噬细胞、EMT活化和转移，而WM_Score-low组与生存优势、凋亡和细胞周期信号通路相关。WM_Score与CRC的转录和转录后事件调控高度相关。
对于抗癌药物，WM_Score与靶向致癌相关通路如MAPK、EGFR、mTOR信号通路的药物呈高度负相关(药物敏感)，与靶向凋亡和细胞周期的药物呈正相关(耐药性)。
重要的是，WM_Score与PD-L1阻断的疗效相关，这表明靶向这些“writers”的潜在药物的开发有助于免疫治疗的临床效益。（本文的图文总结如下figure7 S所示：）
结果
1. CRC中四种RNA修饰“writers”的遗传和转录改变
根据已发表数据，本研究共纳入26个RNA修饰“writers”，其中A-I修饰“writers”3个，m6A修饰“writers”7个，m1A修饰“writers”4个，APA修饰“writers”12个。
为了确定癌症中RNA修饰作者的基因改变，评估了26位writers的非沉默体细胞突变的患病率。在TCGA的LAML、PCPG和UVM三个癌症队列中，单个writer突变频率相对较低，而COAD队列中“writers”突变频率相对较高(图S2A)。
在404个COAD样本中，119个(29.46%)存在RNA修饰“writers”突变(图1A)。然而，有这些“writers”突变的CRC患者总生存期比没有突变的患者短(图1B)，提示“writer”基因改变可能在CRC中起功能性作用。
接下来，使用hallmark基因集进行了基因集变异分析（GSVA）的富集分析以比较“writers”突变组和非突变组。发现在突变组中更多的肿瘤标志物相关基因集被富集（图S2B）。提示writer基因突变可能导致功能改变，影响结肠癌的生存预后。
然后，检测这些“writers”的体细胞拷贝数变化，发现CSTF1、CPSF1/4、ZC3H13和KIAA1429具有广泛的拷贝数变化(CNV)增益(图1C)。为了确定这些基因变异是否影响了CRC患者中RNA修饰“writer”的表达，比较了配对正常和CRC样本中调节因子mRNA的变化，发现大多数“writer”的表达在CRC中显著增加(图1D-G)。
与正常结肠组织相比，CRC组织中CNV增加的RNA修饰“writers”(如CSTF1和CPSF1)更频繁(图1C和G)，表明CNV可能是“writers” mRNA表达的调节因子。然而，一些“writer”表达上调，但CNV丢失频率高。
为探讨CNV值与肿瘤组织中mRNA表达的差异，选取8位CNV丢失率超过20%的研究者，根据CNV值将大肠癌患者分为4组，包括CNV增加、CNV减少和CNV无显著改变。
然后，比较了这几组“writer”mRNA的表达情况(图S2C)。在这些“writer”中，CNV增加的患者比CNV减少的患者表达更高。与正常组织相比，METTL14、ADORB1、CPSF2、PABPN1在CNV减少组中表达显著下调或无显著变化。
肿瘤的发生是一个复杂的过程，CNV的变化不能完全解释肿瘤与正常组织中“writer”表达的差异。虽然许多“writer”的表达变化可以用CNV来解释，但CNV是部分而不是唯一调控mRNA表达的因子。DNA甲基化和转录因子等其他特征，可以调节基因表达。
这一分析表明，正常和CRC样本之间的基因景观和RNA修饰“writer”的表达具有高度的异质性，RNA修饰“writer”的表达失衡在CRC的发生和发展中具有潜在的作用。
2. 与癌症特征和免疫浸润相关的RNA修饰“writers”的独特模式
为了全面了解参与CRC肿瘤发生的“writers”的表达模式，选择8个包含临床信息的数据集(GSE41568、GSE39582、GSE13294、GSE14333、GSE18105、GSE20916、GSE21510、GSE37892)中的1695个CRC样本进行进一步分析。单因素Cox回归显示，在GSE39582数据集中，26个RNA修饰“writers”中有10个与CRC预后相关(图S3A)。
为了探究writers之间的关系，计算了26个writers在CRC中的表达的成对相关性，发现正相关比负相关更频繁。发现不仅同一类别中RNA修饰“writers”的表达显著相关，而且不同类型的修饰“writers”之间也存在显著相关。
ADARB2、ZC3H13和PABPN1的表达与其他“writers”呈负相关。而TRMT61B、TRMT6、KIAA1429、TRMT10C、CSTF2/3、CPSF4、CLP1的表达呈正相关(图2A)。因此，“writers”之间的交互可能对单个肿瘤之间产生不同的RNA修饰模式很重要。
接下来，根据26个RNA修饰“writers”的表达谱，应用共识聚类(Consensus Clustering)对RNA修饰模式定性不同的患者进行分类。经过非监督聚类，合并数据集中的727例CRC患者在Cluster_1中被识别，而其他968例患者在Cluster_2中被识别(图2B)。
在RNA修饰模式的预后分析中，Cluster_2修饰模式的亚型中显示出特别显著的生存优势(图2C)。为了鉴定这些不同的RNA修饰模式的生物学意义，进行GSVA富集分析。Cluster_1显著富集于基质和致癌激活通路，提示RNA修饰“writers”可能与肿瘤发生有关。Cluster_2在与增殖和凋亡相关的通路中富集(图2C)。
大量研究证实了TME浸润免疫细胞与RNA修饰之间的关系。因此，本文试图研究“writers”在TME中的功能作用。为了比较RNA修饰模式之间免疫细胞成分的差异，使用CIBERSORT方法，这是一种使用支持向量回归来确定肿瘤中免疫细胞类型的反卷积算法。
该方法表明RNA修饰“writers”可能与TME细胞浸润有很强的相关性(图S3B)。分析两种RNA修饰簇在TME细胞浸润方面的差异。观察到Cluster_1中M2巨噬细胞、调节性细胞(Tregs)、T滤泡辅助细胞(Thf细胞)和T γδ细胞浸润率较高。
在Cluster_2中，活化的树突状细胞、自然杀伤细胞和M1巨噬细胞的浸润增加(图2E)。总的来说，RNA修饰的Cluster_1在免疫抑制细胞中富集，如M2巨噬细胞和Treg，预示预后不良(图2D)。M2巨噬细胞在Cluster_1中显著富集，而M1巨噬细胞在Cluster_2中占优势(图2E-F)。
同样，对巨噬细胞标记物的表达分析显示，M2巨噬细胞标记基因IL1R1、FIZ1、TGFB1、IL10、ARG1在Cluster_1中较Cluster_2中显著上调，而M1巨噬细胞标记基因IL12A、NOS2、IL23A、IL15RA显著下调(图2G)。这表明RNA修饰模式影响了特定免疫细胞类型的浸润程度，但没有改变浸润免疫细胞的类型。
本文总结
本研究对CRC中的四种RNA修饰“writers”进行了系统的综合分析，揭示了它们影响肿瘤微环境及其与CRC预后的关系的广泛调控机制。
构建了WM_Score模型，记录了“writers”在转录和转录后事件中的交互和调节作用，并确定了它们在靶向治疗和免疫治疗中的治疗用途。这项工作强调了RNA修饰串扰的关键临床意义，并有助于为CRC患者制定个性化的免疫治疗策略。
本研究的亮点在于不仅强调了RNA修饰“writers”在癌症治疗中的交互和潜在的临床应用，而且生信分析逻辑思路清晰，是一篇非常值得学习研究的文章。
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