基因敲入或基因点突变BEAS-2B细胞系
BEAS-2B细胞通过电穿孔法与gRNA、Cas9和Donor载体或Oligo共转染，然后挑单克隆。阳性克隆将通过测序进行验证。具体案例如下：
图3 BEAS-2B细胞系的敲入策略
图4 BEAS-2B细胞系的点突变策略
（1）点突变案例-1
为了研究突变体NRASQ61K在血管再生中的特异性影响，在正常（非肿瘤）人支气管上皮细胞(BEAS-2B)中进行了敲入。与野生型(WT)细胞相比，在CAM上生长的NRASQ61K过表达细胞的特征是血管系统紊乱，并存在若干个出血区域。为了证实体内NRASQ61K的促血管生成作用，在裸鼠身上进行了Matrigel plug试验，结果如图5B中所示，NRASQ61K表达细胞显示出血管再生明显增加，呈亮红色。然而，野生型细胞中的血管再生可以忽略不计，并且血红蛋白水平较低。除此之外，研究者还发现NRASQ61K在体外的表达显著增加了类毛细管网络，如图5C所示。而肿瘤血管生成的关键所在正是细胞在骨髓上自发形成毛细血管样结构，因此，NRASQ61K的表达会在一定程度上促进肿瘤血管的生成。
图5 将NRASQ61K敲入BEAS-2B细胞
（2）点突变案例-2
COX-2基因启动子区域包含NFκB、AP-1和NFAT结合位点，它们可以被这些转录因子识别，进而导致COX-2的转录。为了确定NFAT是否通过直接结合COX-2启动子区域来调节COX-2的表达，研究人员应用CRISPR/Cas9技术，对COX-2-Luc启动子区域的两个NFAT结合位点进行了点突变。结果表明，这种突变导致亚砷酸盐暴露诱导的COX-2转录受损。并且研究人员发现，与COX-2诱导相比，亚砷酸盐在研究中的NFAT激活达到了更早的峰值。因为亚砷酸盐的暴露只会导致BEAS-2B细胞中的NFAT的激活，而不是AP-1和NFκB的激活，所以亚砷酸盐激活NFAT是BEAS-2B细胞中COX-2诱导的原因。
另外为了证实NFAT3 在 BEAS-2B 细胞中亚砷酸盐诱导的 COX-2 表达中的重要作用，研究人员构建并使用了siNFAT3，他们将细胞用10μm NFAT 选择性抑制剂预处理，然后暴露于20μm亚砷酸盐中，研究人员发现BEAS-2B细胞中siNFAT3的稳定转染导致BEAS-2B细胞中NFAT3蛋白表达的明显降低(图. 6 中b)。siNFAT3对NFAT3表达的特异性抑制阻断了亚砷酸盐诱导的COX-2转录和蛋白质表达(图. 6 中e和h）。
这些结果表明了，NFAT3是BEAS-2B细胞中亚砷酸盐诱导COX-2的主要介质。
图6 BEAS-2B细胞系的点突变案例