Brain：帕金森病的发病新机制
导读：
帕金森病的特征是黑质致密部内多巴胺能神经元进行性变性，存活的神经元存在蛋白聚集体。LRRK2 G2019S突变是家族性帕金森病病例的主要决定因素之一，并导致具有多形性病理的晚发性帕金森病，包括a-突触核蛋白积累和蛋白包涵体的沉积。Brain期刊（IF=13.501）近期发表了题为《LRRK2 G2019S kinase activity triggers neurotoxic NSF aggregation》的研究论文，作者团队报道了LRRK2可磷酸化 N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)，并在携带G2019S变异的帕金森病患者的基底神经节标本以及表达LRRK2 G2019S变异的细胞和动物模型中观察到含有NSF的聚集体，而且LRRK2 G2019S激酶活性诱导NSF在毒性聚集体中的积累，同时自噬诱导下可清除NSF聚集，挽救在老年hG2019S小鼠中观察到的运动和认知障碍。研究人员认为LRRK2 G2019S病理性磷酸化影响NSF生化特性，从而引起细胞毒性蛋白包涵体的形成，贡献于帕金森病的发病。
hG2019S小鼠的年龄依赖性运动和认知障碍
作者前期研究描述了hG2019S BAC (hG2019S)小鼠中年龄依赖性的神经病理和行为表型。在一组行为测试中对年龄匹配的野生型和hG2019S雄性小鼠在3、6、12和18个月时进行了表征，包括自发运动活动（图1A、B）、平衡木、爬杆实验、转棒试验（图1 C-G）和新物体识别（1H)，而自发活动在基因型之间没有差异。3月龄野生型和hG2019S队列在所有实验中的表现相同，但在32 rpm转棒试验中，hG2019S小鼠显著受损。我们注意到，hG2019S小鼠在6个月平衡木和爬杆试验、12个月和18个月转棒(12 rpm)、6个月和18个月转棒(32 rpm)以及6个月和12个月转棒阻力试验时的运动能力受损。最后，6、12和18月龄hG2019S小鼠在新物体识别测试中的平均辨别指数评分显著较差。这些观察结果表明，6月龄hG2019S小鼠表现出运动和认知障碍。
图1 hG2019S小鼠的年龄依赖性运动和认知障碍
G2019S突变与NSF聚集体的沉积相关
蛋白质聚集是帕金森病公认的组织学标志，而LC3修饰帕金森病和路易体痴呆患者的路易体。于是作者通过LC3抗体染色研究6月龄野生型和hG2019S雄性小鼠黑质、纹状体、皮质和海马标本中蛋白聚集体的存在。路易小体和相关的核内包涵体包含90多个分子，包括NSF，因此将其描述为LRRK2功能伴侣，并分析了NSF在hG2019S皮层神经元中的亚细胞分布。作者发现NSF定位于LC3和p62阳性的体细胞结构（图 2AB），即类似蛋白聚集体。蛋白聚集体形成高分子量复合物，在滤过阻滞试验中被醋酸纤维素保留；并证实6月龄hG2019S小鼠大脑制备的样本中存在NSF高分子量复合物（图 2 CD）。蛋白质聚集体的一个公认特征是对蛋白酶K消化的抵抗力，于是通过收集6月龄野生型和hG2019S小鼠的脑匀浆中有限的蛋白水解来表征NSF聚集体。经蛋白酶K消化，100 kDa分子量条带，对应于全长NSF蛋白，在野生型而非hG2019S小鼠制备的样品中逐渐消失（图 2EF）。组织学分析还发现6月龄hG2019S小鼠制备的黑质、纹状体、海马和皮质切片中存在NSF阳性聚集体（图 2GH）。
图2 HG2019S小鼠中的NSF聚集
接下来作者对从健康对照、特发性和G2019S帕金森病病例中获得的死后基底神经节标本进行了表征。从生物化学的角度来看，洗涤剂的溶解度曲线表征了蛋白质聚集体。有趣的是，各组TBS可溶性NSF水平相当（图 3AC），而特发性或G2019S帕金森病患者制备的样品中SDS-可溶性部分NSF的产量较高（图 3BD）。此外，在特发性和G2019S帕金森病病例中，发现NSF修饰了一部分a-突触核蛋白阳性结构（图 3E）。通过滤过阻滞试验，作者注意到NSF在G2019S多巴胺能神经元中制备的样品中可形成高分子量复合物（图 3FG）。以上证据表明，在鼠和人体模型中，LRRK2 G2019S突变与NSF聚集体的沉积相关。
图3 在人源性样本中的NSF聚合
LRRK2 G2019S激酶活性触发NSF聚集
作者团队研发了专门识别在THR645的NSF磷酸化的抗体，可见G2019S患者标本采集的死后样本中Thr645位点的NSF磷酸化增加（图 4AC），NSF聚集在6月龄hG2019S小鼠的几个脑区（图 4DE）。NSF的结构分析(Protein Data Bank ID：3J94)发现，T645的侧链靠近参与NSF寡聚化的D2结构域上的ATP结合位点[氨基酸(aa)490-744]（图 4FG）。通过差异洗涤剂溶解度试验，发现从hG2019S皮层神经元收集的不溶性部分中NSF量增加（图 4HI）。因此，作者认为其他机制必须是LRRK2 G2019S依赖性NSF聚集的基础。除此以外，磷酸化可能直接影响蛋白质折叠和低聚状态。为了解析NSF在Thr645上磷酸化的生物学结果，通过定点直接诱变产生了NSF拟磷酸化变体NSF T645D。NSF T645D在不溶性部分强烈富集，表现为洗涤剂溶解度的差异（图 4JK）。引人注目的是，一旦与血凝素(HA)-NSF野生型共表达，NSF T645D影响野生型蛋白的溶解度（图 4JL）。以上观察结果表明，T645的磷酸化可触发NSF聚集。一旦包埋在聚集体中，蛋白质则被泛素切割和标记。western blotting分析发现，NSF T645D发生蛋白水解切割，并被泛素强烈修饰（图 4MO)。在泛素链中，每个单体可以通过不同的赖氨酸残基偶联，生成功能性编码。
图4 LRRK2磷酸化可引起NSF聚合
NSF过度表达以LRRK2激酶依赖的方式对hG2019S神经元有害
为了研究NSF聚集是否具有神经毒性，团队应用单独表达mCherry的慢病毒感染野生型和hG2019S皮层神经元，或与NSF野生型、磷酸化无效变体NSF T645A或磷酸化模拟变体NSF T645D共同感染。用 DMSO 或 GSK2578215A （GSK，每日0.2 mm）处理从DIV10到DIV14的神经元，然后在DIV16处理（图5A )。神经突回缩是神经元损伤的既定标志物，形态学分析显示，NSF野生型或T645A的过度表达对野生型神经元形态没有重大影响。相反，NSF T645D对野生型神经元有害。值得注意的是，NSF野生型过表达导致hG2019S神经元神经突数量显著减少。在过表达磷酸化无效NSF T645A变异体的hG2019S神经元中不存在形态学表型（图5B)，通过MTT实验对神经元活力的分析证实了这一结果（图5C)。有趣的是，用LRRK2激酶抑制剂GSK2578215A长期处理阻止了表达野生型NSF的hG2019S培养物的神经突丢失，但没有改善整体活力。总的来说，这些数据表明NSF对LRRK2磷酸化具有神经毒性。
图5 LRRK2磷酸化触发NSF毒性
海藻糖处理清除NSF聚集体
海藻糖处理后可减少hG2019S小鼠在黑质（图6）、纹状体（图7）中NSF修饰的细胞数量。Caspase-3裂解先于凋亡细胞死亡。我们注意到黑质（图6）和纹状体（图7）中裂解的caspase-3阳性细胞显著增加，TH密度无任何明显损失。海藻糖给药显著减少了hG2019S小鼠黑质（图6）、纹状体（图7）中的caspase-3阳性细胞数量。我们的观察结果表明，海藻糖处理可清除hG2019S小鼠脑中的NSF聚集并减少细胞死亡。
图6 海藻糖治疗拯救了实质性NIGRA中HG2019S小鼠的组织化学病理学标志
图7 海藻糖治疗拯救了纹状体中Hg2019s小鼠的组织化学病理学标志
海藻糖治疗可改善hG2019S小鼠的运动和认知表型
接下来团队对6月龄hG2019S和野生型雄性小鼠在海藻糖长期治疗后的运动和认知表现进行分析（图8）：发现海藻糖处理后，动物的运动和认知能力得到恢复，尤为显著的是改善了6 mm平衡木（图8 C）、32 rpm转棒（图8F）、12 rpm转棒阻力（图8G）和新物体识别（图8H) 的性能。总之，这些观察结果表明海藻糖给药有利于挽救hG2019S小鼠的行为缺陷。
图8 海藻糖治疗救援HG2019S小鼠的电动机和认知缺陷
NSF是突触前机制的关键组成部分，胞质NSF的耗竭损害膜融合机制，导致胞内囊泡的聚集，NSF聚集可能影响突触前融合机制。目前，几种具脑渗透性的LRRK2选择性抑制剂已被确定，然而，LRRK2在CNS以外的其他器官（包括肺、肾和免疫系统）中的广泛表达引起了关于副作用的问题。随后，作者发现海藻糖长期给药可降低老年G2019S小鼠中的NSF聚集，并改善了运动和认知表型。然而在突变小鼠中p62阳性的NSF聚集体募集自噬机制，而在野生型小鼠中这种分解代谢过程的长期激活可能自我消化蛋白质和细胞器，并最终导致细胞毒性。海藻糖虽在多种神经系统疾病中具有保护作用，但是同样存在着药代动力学特性较差、生物利用度受限和累及消化系统等不足，由此严重降低了将海藻糖引入帕金森病患者临床管理的可能性。综上所述，增强自噬是LRRK2帕金森病的一种潜在的治疗策略，具有应用于临床的相关药物的潜力。
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Pischedda F, Cirnaru MD, Ponzoni L, Sandre M, Biosa A, Carrion MP, Marin O, Morari M, Pan L, Greggio E, Bandopadhyay R, Sala M, Piccoli G. LRRK2 G2019S kinase activity triggers neurotoxic NSF aggregation. Brain. 2021 Jun 22;144(5):1509-1525.
编 译 / 周 喣
校 审 /蔡玉洁