如何正确选择基因敲除敲入质粒？

研究基因功能最有效的方法之一是用实验室设计的DNA片段取代或破坏基因，使其失活或“敲除”。构建特殊的质粒可以通过同源重组替代酵母、小鼠或果蝇中的基因。其原理很简单:将一个带有目标序列修复模板的质粒递送到细胞，该细胞将模板与内源性基因重组。在这里，我们将主要探讨用于灭活哺乳动物细胞中特定基因的技术和质粒。尽管CRISPR的敲除/敲入系统非常流行，但这个系统仍然很有价值，特别是在CRISPR不能使用的情况下(例如，附近没有合适的PAM序列，或者你感兴趣的基因很难用gRNA特异性靶向)。在选择敲除策略时，一定要记住这些技巧!

敲除质粒

1.同源重组是一种准确修复破坏性的双链断裂的机制，核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间进行交换。基因靶向则是利用这一自然过程，运用一种特殊设计的含有同源序列的载体，将目标基因位点替换为同源序列。为了更了解这个过程，我们将介绍一个旨在敲除给定基因的第2外显子的实验。

设计你的目标结构。为了在细胞中重组，至少需要2 kb的同源序列，但6到14 kb的同源序列是靶向结构的典型特征。在图1所示的例子中，与目标基因外显子1和外显子3相对应的序列已克隆到载体抗生素抗性基因的任意一侧。为了避免选择那些结构随机整合到基因组中的细胞，像HSV胸苷激酶(HSV-tk)这样的阴性选择标记被包含在一个同源臂之外。当我们稍后选择细胞时，我们将首先对抗生素抗性基因进行阳性选择，然后对阴性选择标记进行反选择——这后一步将杀死许多随机整合了全部或大部分质粒的细胞。

2.呈递质粒给宿主细胞。重组后，目标基因的第2外显子将从染色体上移除，并被抗性基因取代。这样基因就被破坏或敲除了。

3.利用正负选择确定正确的重组细胞。重组是一个偶然事件，所以你必须选择而不是筛选已经发生重组的细胞。新霉素、嘌呤霉素和潮霉素耐药基因通常用于阳性选择。正选择标记对重组进行选择，而负选择标记对不适当的、随机的到不同位点的重组进行选择。正确重组的细胞不会包含负选择标记，但随机重组的细胞可能会将负选择标记重组到基因组。非同源重组的最终产物可以在正选择中存活，但对负选择是敏感的。

4.去掉阳性选择标记。由于抗生素耐药基因可以影响细胞的表型，研究人员通常在选择完成后使用Cre/Lox重组系统去除阳性选择标记。通过插入侧翼LoxP序列将抗性基因“包围”，再通过添加Cre重组酶将其去除(图2)。

基因敲除/敲入质粒

基因靶向方法也可以完成插入或敲入任何基因、标签或突变外显子。为此，将要插入的序列与阳性选择标记一起克隆到载体的同源序列之间。为了敲除一个给定的基因并将GFP插入到基因组中，我们将创建一个类似如下图所示的质粒，将GFP的序列和新霉素抗性(NeoR)基因克隆在目标基因的第1和第3外显子之间。重组后，GFP/NeoR被插入到第2外显子的位置。因此，目标基因被破坏(敲除)，而插入的GFP被表达(敲入)。如上例所示，可以使用Cre重组酶去除抗性基因。因为GFP被内源性启动子所控制，所以可以使用GFP的表达来追踪参与发育的细胞或被该启动子响应的其他生理病理事件。你也可以使用这种方法用GFP标记内源性蛋白。

条件性敲除

在上文中描述的方法和质粒是敲除感兴趣的非必需基因的简单方法。然而，如果你想要的研究的基因是必要的，敲除后可能是致命的，这就需要创造一个条件性敲除。

为了进行条件性敲除，研究人员经常使用前面描述的Cre/Lox系统（添加上文的链接）。在这种情况下，你可以设计一个靶向载体，使抗性基因和目标基因外显子旁边有三个LoxP位点(图4)。当重组发生时，该基因仍能正常工作，因为它的一个外显子只是被LoxP位点旁边的相同序列所取代，而抗性基因则被放置在一个内含子中。

重组发生后，首先使用Cre重组酶去除抗性标记。由于有3个loxP站点，重组可以以多种方式发生。期望的重组将只去除NeoR并留下第2外显子，如图4中的第4行所示。由于loxP位点位于内含子区，该基因仍将被表达。你首先要用PCR来筛选这种特定的重组结果，养成单克隆细胞系。然后你可以通过第二轮Cre重组酶有条件地去除这个外显子(从而敲除该基因)。

敲除质粒的未来

尽管这些方法已经被用于构建许多敲除细胞系和动物模型，但它们的效率非常低，大约只有0.1%。相比之下，CRISPR等新的基因编辑技术更容易使用且在基因敲除方面也更有效。CRISPR可以靶向基因组序列，创造一个可以通过同源重组修复的断裂。而模板可以包括可条件性敲除等位基因的loxP位点。尽管CRISPR非常适合基因敲除，但基因的大片段删除依然很困难。

第一只基因敲除小鼠诞生于1989年。近年来随着传统的敲除和新的CRISPR工具的不断完善，细胞和小鼠的敲除系的数量正在不断增加。新的基因组工程工具也为创建新的基因敲除动物模型提供了更多希望。