Transwell侵袭实验操作步骤
1、实验前一天,将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜,Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。
2、包被基底膜:Matrigel基质胶以1:8稀释后包被transwell小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作,否则Matrigel在10℃以上即会凝固),3小时风干。
3、水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。
4、常规胰酶消化细胞,PBS洗1-2遍去除血清的影响,用无血清培养基重悬细胞,调整细胞密度为5*105个/mL。
5、取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室, 24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。
6、培养板置于37℃的CO2培养箱中,依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。
7、取出小室,PBS淋洗2遍,用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞,在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min,结晶紫溶液染色15 min。
8、倒置显微镜下拍照,每个样本随机计数10个视野,取平均值,统计分析。
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