佳作推荐|多组学探究反应器中的微生态！
每个角落、每个时刻都在上演着微生物的故事。今天的佳作推荐是在废水处理的反应器中微生物的故事，一起来探究这是一部“宫斗剧”还是“偶像剧”。
多组学分析揭示单级硝化厌氧氨氧化反应器运行模式和微生物互作对微生物群落的影响
Exploring the effects of operational mode and microbial interactions on bacterial community assembly in a one-stage partial nitritation anammox reactor using integrated multi-omics
作者：Yulin Wang, Qigui Niu, Xu Zhang et al.
期刊：Microbiome
时间：2019-8
IF：9.86
一、研究背景
在使用局部硝化厌氧氨氧化(partial-nitritation anammox，PNA)反应器进行废水脱氮处理时，厌氧氨氧化菌（AOB）的代谢能力以及与其关联的微生物互作发挥了重要功能，但有关非生物和生物因素如何塑造PNA反应器微生物群落结构的报道还很缺乏。
二、实验设计
1、 反应器运行：在1.6 L实验用PNA反应器中接种氧氨氧化微生物并进行培养。
2、 采样及核酸的提取、测序及分析：于特定反应周期及反应器的特定位点取样（图1），在Illumina Hiseq 4000平台分别进行16S rRNA、DNA和RNA高通量测序。将质控后的16S rRNA reads聚类成OTU并比对SILVA数据库；质控后的宏基因组reads进行de novo组装，复原微生物基因组（metagenome-assembled genomes，MAGs）并进行注释；将非rRNA reads回贴到预测ORFs上，分析转录本差异。
3、 蛋白提取和质谱分析：采集第261天的污泥样品（图1），提取蛋白并用质谱仪进行分析。
三、结果及讨论
1、单级反应器性能
将厌氧氨氧化污泥放入PNA反应器中培养。在75天时观察到除氮性能下降，因此于40天时调整反应器参数。经2个月的恢复，除氮率从150.5 mgN/L/day升高到307.5 mgN/L/day并达到一个新的稳定期。在150天左右污泥自发聚集成颗粒状，说明微生物分泌了比初期（1天）更多的胞外聚合物。在204天、2010天和213天时，需氧阶段的氨盐下降速率比厌氧阶段的快（图1），而氨氧化产物-亚硝酸盐的积累并没有显著增加，说明此时氨氧化菌的除氮效率高。
2、细菌群落演替
16S rRNA测序结果表明细菌群落变化明显。浮霉菌门的相对丰度在I期有所下降，而在III期则增加了将近2倍。优势物种从Kuenenia属变成了Brocadia属。相对丰富＞0.3%的OTUs可聚类为3大类（图2a）。亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）的平均相对丰度为0.06%，几乎无法检测，说明反应器的运行模式显著降低了NOB与氨氧化菌竞争亚硝酸盐的能力。
从204天、210天和213天的宏基因组数据中成功构建了49个MAGs，它们代表了反应器中最活跃的细菌类群。有86.1%的转录组reads可以比对到MAGs上。从种泥中组装出24个MAGs，9个为种泥特有，但能比对上这9个MAGs的转录组reads序列不足0.5%。总之，这58个MAGs代表了在厌氧氨氧化污泥中的主要组成群落。
新组装的MAGs表明了物种的相对丰度产生了变化（图2b）。主要在种泥中出现的AMX3（氨氧化菌的一种）在SBR运行约200天后几乎无法再检测到，相反，种泥中的低丰度细菌（包括AOB1（该研究中作者通过组装发现了三种新的AOB，分别命名AOB1、AOB2和AOB3）和AMX1）却在此时占优。18个MAGs的丰度始终很低（＜0.5%）。
如图3的基因组进化树所示，我们从氨氧化污泥中组装出3个氨氧化MAGs和3个AOB的MAGs。大多数MAGs都拥有高质量基因组（完整性＞90%，污染率＜5%），且这些细菌门在氨氧化系统中广泛存在。
3、氮代谢是最活跃的细菌活动
在PNA反应器的SBR运行模式下，新发现的2个氨氧化菌AMX1和AMX2的代谢活动最为活跃，它们贡献了超过66%的转录组数据（图4a），261天的样品中氨氧化菌的蛋白达到了总量的81.1%（加权）和82.9%（非加权）。在第二活跃菌群AOB中，氮代谢蛋白是其他代谢蛋白的一百多倍（图4c）。这些数据说明氮代谢是最重要的细菌活动。
在厌氧和需氧阶段，只有约1%的基因存在转录差异（图 5）。与其他氮代谢途径相比，氨氧化代谢基因的转录水平最高、蛋白表达活动最强烈（图5ab）。AMX1和AMX2的联氨合酶HZS占了氨氧化菌氮代谢约80%的蛋白总量。在优势物种AOB1中，编码铵单氧酶AMO的3个亚基的基因表达活跃，而含铜亚硝酸还原酶CuNiR的表达特别活跃，且在需氧阶段显著提高（图 5c）。
一些没有固氮代谢途径的微生物能转录或部分转录反硝化代谢相关基因（图 5c）。丰度最高的异养菌ARM1能表达和翻译呼吸硝酸还原酶NarGH和细胞色素c亚硝酸还原酶NrfH，说明这种微生物进行无氧呼吸时可以利用硝酸/亚硝酸盐作为电子受体。氮氧化物主要由大量编码一氧化氮还原酶Nor的AOB降解。
4、大量异养生物对电子供体的偏好随着氨氧化菌的转移而改变
在PNA反应器中，丰度＞1%的主要是反硝化菌，它们可以用亚硝酸盐、硝酸盐和气态氮氧化物作为电子受体，进行无氧呼吸（图5c）。我们推测，在没有氮源的情况下，异养生物将和作为电子供体的AOB/氨氧化菌发生密切互作。
5、大量异营养缺陷型造就核心细菌群落组成
反应器中大多细菌是营养缺陷型，因此氨基酸、微生物等也会影响细菌群落结构。AMX1和AMX2是几乎可以合成所有氨基酸的原养菌（图6）。但在氨氧化MAGs中未检测到任何编码参与蛋氨酸合成的半胱氨酸裂解酶或半胱氨酸合酶基因，而AOB1高度表达这两个基因，说明氨氧化菌能从AOB的代谢中获利。
长期运行反应器后，丰度最高的异养菌是营养缺陷型，它们比其他丰度低的异养菌需要更多的氨基酸，却缺失大量的氨基酸合成基因，且通常基因表达量也低于其他微生物（图6）。例如CFX需要更多种类的胞外氨基酸，在CFX1和ARM1中膜转运基因表达最活跃的一类。而某些低丰度菌中有多类氨基酸合成基因，一些基因甚至高度表达（图6）。在几种优势异养菌中，维生素B合成途径也存在缺失。实验证明，MAGs缺失泛酸合成关键基因，说明氨氧化菌所需的胞外泛酸盐依赖其他细菌产生，而长时间的SBR运作后，氨氧化菌是唯一能够生产VB12的核心微生物。
经过长时间处理，丰度最高的异养菌PLA1得到富集，而膜转运基因的表达并不活跃，说明PLA1已经发展了其他适应策略：大量表达分泌基因。在PLA1与其他细菌竞争时，这些基因发挥了重要作用。
以上研究结果证实，舍弃高耗能的氨基酸合成及膜转运过程，优势异养菌能有更强的适应能力。
四、小结与亮点
本研究运用多种组学，探索了PNA反应器微生物在生物和非生物胁迫条件下的群落组成和演替，找到了各反应周期的优势微生物及组装了它们的基因组；研究还结合微生物基因转录和蛋白表达情况，揭示了营养缺陷型群落在反应器中的适应机制，说明微生物之间有着密切的互作，为未来的污水处理提供了研究依据。