蛋白质含量的检测、原理及注意事项

一、食品中蛋白含量测定的意义

蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。人体内酸碱平衡、水平衡的维持，遗传信息的传递、物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解产物来构成自身的蛋白质，因此蛋白质是人体的重要营养物质，也是食品中重要营养指标。

在各种食品中，蛋白质的含量各不相同。测定食品中蛋白含量，对评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、知道经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。

二、蛋白质的组成及结构

蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（氧）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P（磷）、S（硫）、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（硼）、Mn(锰)、I（碘）、Mo（钼）等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50% ，氢7% ，氧23% ，氮16% ，硫0~3% 及其他微量元素。一切蛋白质都含N元素，且各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。蛋白质系数：任何生物样品中每1gN的存在，就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在， 6.25常称为蛋白质常数。
  蛋白质是以氨基酸为基本单位构成的生物高分子。蛋白质分子上氨基酸的序列和由此形成的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构，蛋白质分子的结构决定了它的功能。
  氨基酸是构成蛋白质的基本单元，蛋白会约含有20种氨基酸，在细胞质中的核糖体上，将氨基酸分子互相连接成肽链。一个氨基酸分子的氨基和另一个氨基酸分子的羧基，脱去一分子水而连接起来，这种结合方式叫做脱水缩合。通过缩合反应，在羧基和氨基之间形成的连接两个氨基酸分子的那个键叫做肽键。由肽键连接形成的化合物称为肽。

三、蛋白质的检测原理

图2半微量法测蛋白

不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的。

1 消化：

样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。

2 消化过程中：

在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。

为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。

3 蒸馏：

样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。

4 吸收与滴定：

蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
 
四、步骤

准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在凯氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至凯氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。

五、注意事项

1 样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细过筛，液体样要混合均匀。

2 样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。

3 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。

4 有机物分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g样品  K2SO4：H2SO4=7g：12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的。

还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10 g：20ml

5 消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。

6 在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

7 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

8 消化剂绿色后继续消化30分钟即可

9 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。

10 氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。

11 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。

12 蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。

13 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。