[isme]土壤耕作历史通过塑造根际微生物改变植物表型
Legacy of land use history determines reprogramming of plant physiology by soil microbiomeThe ISME Journal, [9.5]DOI:10.1038/s41396-018-0300-0Published online: 27 October 2018第一作者：Xiaogang Li1,2通讯作者Xingxiang Wang1,5 (email: xxwang@issas.ac.cnxgli@issas.ac.cn)合作作者：Alexandre Jousset3 Wietse de Boer2,4 Víctor J. Carrión2 Taolin Zhang1 Eiko E. Kuramae 2
主要单位：
1 CAS Key Laboratory of Soil Environment and PollutionRemediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy ofSciences, Nanjing 210008, China
2 Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute ofEcology, NIOO-KNAW, Wageningen 6708 PB, The Netherlands
本文总结
译者想说
最近一段时间，就根际，植物同微生物的相互作用，这块大蛋糕正在不管有人去关注，并拿起了勺子，相信在未来几年中，随着各种技术的不断成熟，试验条件的不断优化，我们可以看到更多的植物同微生物相互作用的优秀文章。关于土壤记忆，土壤遗产，或者说，植物土壤的微生物的反馈。我已经关注了并解读了第三篇文章了。这三篇文章关注的略有不同，第一篇关注细菌叶部病原菌入侵植物，根际微生物会保存记忆并影响后续植物对病原菌的响应。突出这一响应是通过改变微生物群落来作用一植物的。是通过改变植物ISR过程来影响植物响应病原菌入侵的。第二篇文章ISME，也是关注真菌病原菌入侵下，植物对土壤的改变会通过微生物反馈给后代植物，同样是土壤记忆或者遗产，但是第二篇文章使用的是寄生式真菌作为病原菌研究对象，不同于第一篇文章（使用叶部细菌病原菌为研究对象）。同时第二篇文章做了培养组学的内容，从纯菌的角度验证植物招募有益微生物并协助抵御植物病害。而这第三篇，也就是今天的这一篇将尺度置于轮作和连坐这两种农业耕作措施上来。解释的是历史作物对当代作物的土壤遗产。但同前两篇文章均关注土壤记忆效应，并且不同的作者均将其归纳为根系分泌物的遗留效应，似乎都承认根系分泌物的遗留效应使用过改变土壤微生物群落间接作用于后代植物的。而本文更进一步希望后续研究关注根系根系分泌物中化感物质的调控作用（microbiome关注根系分泌物中有机酸和氨基酸的调控作用）。所以我们最起码在目前肯定的是，根系分泌物是调控土壤记忆的只要力量，不同根系分泌物可能在不同土壤记忆中起着调控作用。
摘要
与根系相关的微生物被认为是植物的第二基因组，他们帮助植物获取营养、生产生长激素和抵御疾病。我们猜想，由于作物从土体土壤中招募根际微生物，而农耕会引起土体（不受植物根系影响的土壤）土壤微生物群落组成的变化，从而影响根际微生物群落。在本研究中，我们对了不同农艺管理、连坐和轮作土壤中生长的花生植株根系进行了转录组测定，并使用鸟枪法对根际微生物进行宏基因组测定分析。我们发现土壤耕作历史对花生招募根际微生物群落都有着显著影响，这表明土壤存在记忆效应。连作会减少土壤根际微生物的多样性，也会富集一些稀有物种，同时对植物代谢过程产生影响，如使营养物质代谢和植物激素生物合成功能衰退。连作通过影响生长素素和细胞分裂素 等基因的下调，脱落酸(abscisic acid)、水杨酸(salicylic acid)、茉莉酸(jasmonic acid)和乙烯(ethylene ))等基因的上调使花生生长受到影响，植株矮小。这些结果表明土壤利用方式会影响根际微生物和植物表型。
引言
土壤微生物群落是植物吸收营养、生长发育以及植物抵抗病害过程的重要参与者。然而，农艺活动可驱动土壤微生物群落结构的改变，从而使其适应来自植物的生物或非生物的胁迫。这表明除草剂以及农药的应用或农耕过程都可能使土壤微生物群落结构以及植株表型发生改变。连坐与轮作相比，前者微生物群落的多样性更低。但连坐带来的影响不一定都是负面的，它可以使病原菌的种类单一化，同时也可招募拮抗菌。但是，对于农业生产是如何影响微生物群落装配的，我们知之甚少。因此，我们应该重点了解根际微生物对作物功能的驱动作用。植物将自身通过光合作用固定的5—21%碳输送到根部。因此，虽然土体土壤存在的可利用有机物质较少，但是根际却是微生物活动的热区。不同植物会招募不同的根际微生物群落，这很大的原因是因为根系沉积物不同。例如，添加香豆酸(p-coumaric acid：根系分泌物)会改变黄瓜幼苗的根际微生物的结构和组成。此外，基于同位素探针的研究结果表明，植物光合作用所合成的碳源会直接被特定的根际微生物群落利用。因此，我们假设连续在同一块天田地种植同种作物会选择性的富集并放大同一种微生物群落。微生物群落影响植物许多功能，例如对营养的吸收能力，生长激素的分泌，对病害的抵御等。通过对植物同微生物间的互相影响研究发现，植物通过多种方式响应根际微生物群落。最近的一项研究指出，花生根际微生物的变化对花生表型生理变化及后续生长会产生显著影响。在本研究中，我们旨在解释和联系作物的耕作历史对花生根际微生物群落以及花生表型的影响。花生植株种植在有着不同耕作历史的土壤中(连坐和轮作)进行，花生的根际微生物群落的评估使用鸟枪法测序，植物根系功能的变化通过转录组测定。
结果
1. 连作和轮作对花生根际微生物群落组装影响不同
Differential assemblage of rhizosphere microbial communities in monocropped and rotation soils
我们分析了不同耕作制度下花生根际微生物群落的宏基因组。首先使用Bray-Curtis距离比较了群落的组成和功能差异。连作与轮作的花生根际微生物群落的结构和功能不同(补充图S2a，图2a)。此外，Shannon指数表明连作花生根际微生物得多样性要低于轮作花生根际微生物的多样性 (p<0.05, 图2b)。变形菌门(Proteobacteria)在根际细菌群落中占据主导地位(占据全部read的62.3–74.3%，补充图.S3a)。与轮作相比，花生连作降低了γ变形菌门(Gammaproteobacteria)(F1,5 =49.7, p=0.002)和β变形菌门(Betaproteobacteria) (F1,5 =40.3, p=0.003)丰度。而连坐花生根际的Deltaproteobacteria门(F1,5 =325.6, p<0.001)的相对丰度略有增加(1倍)。连坐花生根际酸性细菌的数量明显少于轮作花生(F1,5= 482.9, p<0.001)，而放线菌(Actinobacteria)为(F1,5 =73.5, p=0.001),拟杆菌门( Bacteroidetes)(F1,5 =145.3, p<0.001), 厚壁菌门(Firmicutes)(F1,5 =535.7, p<0.001), 绿弯菌门(Chloroflexi)(F1,5 =1218.5, p< 0.001), and疣微菌门 (Verrucomicrobia)(F1,5 =691.3, p<0.001)等在轮作体系花生根际丰富更高。两个最丰富的真菌门，子囊菌门(Ascomycota)(占所有真菌序列的76%)和担子菌门(Basidiomycota)(占所有真菌序列的13%)的丰度也存在显著差异。(补充图S3b)。古菌(Archaea)丰度在连作花生根际明显高于轮作，古菌门Thaumarchaeota得到明显富集(补充图3c)。
图2aPCOA分析表明连作和轮作土壤中花生根际细菌群落存在显著差异(p0.05)。MP:连作土壤花生根际，RP:轮作土壤花生根际。**图2b**花生根际群落Shannon多样性比较表明，连坐明显低于轮作。**图2c**与优势属和普通属相比，花生根际细菌稀有属相对丰度最高。倍数变化定义为(MP-RP)/MP，其中MP为连作土壤中细菌属的相对丰度，RP为轮作土壤中细菌属的相对丰度。红色，倍数变化2。备注：优势属:>1%，一般属:0.1-1%，稀有属:<0.1%。
在属水平上进行深入分析，根据群落中细菌的相对丰度不同，我们按照优势属(>1%)、一般属(0.1-0.1%)和稀有属(<0.1%)进行分类。分析表明，除了 Bordetella (F1,5 =129.5, p<0.001)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)(F1,5=208.0, p<0.001)在连作花生根际明显富集外(图2c)，轮作和连作对其他花生根际优势属的影响并不明显(倍数变化<1)。在一般属中，Ktedonobacter属(F1,5 =575.8, p<0.001)在连作花生根际富集了10倍以上，而其他属没有明显变化(倍数变化<1)。在花生根际中，超过35个稀有属的丰度提高了5倍以上，并且超过150个稀有属的丰度提高了2倍以上(图2c)。从OTU水平上的分析表明，连作花生富集了一些稀有属，并且比轮作花生的细菌丰度高了10倍，这些属分别为ktedonobacter racemifer、Opitutus terrae、icrobium roseum、Chloroflexus aggregans、Thermosediminibacter oceani以及Dehalogenimonas lykanthropoens。在连坐花生根际中，Colletotrichum、Rhizoctonia、Rhizophagus和Dactylellina均占有很高的比例。相比之下,轮作花生根际的Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Trichosporon的相对丰度显著均高于连作花生根际(p <0.05)。
连坐和轮作的根际代谢功能不同
Differences in abundances of metabolic functions in the rhizosphere metagenomes of monocropped and rotation soils
一些代谢通路在连作与轮作根际中有很大差异。(补充表S5)。在连作花生根际富集的通路主要有：KEGG orthologs for bacterial chemotaxis (F1,5=114.3, p<0.001), sphingolipid metabolism (F1,5 =72.0, p=0.001), inositol phosphate metabolism (F1,5 =98.0, p=0.001), starch and sucrose metabolism (F1,5=283.5, p<0.001), nucleotide excision repair (F1,5 =588.0, p<0.001), phenylpropanoid biosynthesis (F1,5 =60.5, p=0.001), glycan degradation (F1,5 =36.1, p=0.004), and fructose and mannose metabolism (F1,5 =108.0, p<0.001) (补充图S2b)。相反，连作花生根际的 lipopolysaccharide biosynthesis (F1,5=288.0, p<0.001), ABC transporter (F1,5 =42.9, p=0.003), 和 riboflavin metabolism (F1,5= 4050.0, p<0.001)通路显著下调。在连作花生根际中，有关养分循环的代谢通路下调，比如：nitrogen metabolism (F1,5 =784.0, p<0.001), sulfur metabolism (F1,5 =72.0, p=0.001), and oxidative phosphorylation (F1,5 =19.4, p=0.012) (补充图S2b)。同时，参与氧化应激的代谢通路下调，如peroxisome(F1,5 =60.5, p=0.001)、半胱氨酸( cysteine )和甲硫氨酸( methionine )(F1,5 =216.0, p<0.001)(补充图S2b)。
促进植物生长的基因在连作花生根际中表达受限
Underrepresentation of genes involved in plant growth promotion in the rhizosphere of monocropped soil
通过KEGG数据库鉴定并注释植物生长相关的基因(补充表S4)。与轮作相比，连作的氮循环基因丰度降低，这些基因分别是：nitronate monooxygenase [EC:1.13.12.16], nitrite reductase [EC:1.7.2.1], and nitric oxide reductase EC:1.7.2.4。nifU基因编码的nitrogen fixation protein，并在连作花生根际的相对丰度显著下调(图3)。一些编码非特异性磷酸酶的基因，在连作花生根际中显著下调,如phosphotransferase [EC:2.7.3.9], phosphoserine phosphatase [EC:2.6.1.52], 3-deoxy-manno-octulosonate-8phosphatase [EC:3.1.3.45], phosphoglycolate phosphatase [EC:4.2.1.12], and inositol-phosphate phosphatase EC:3.1.3.25。这些酶催化有机磷，将其转化为的植物可利用的形式，从而促进植物生长。此外，连作花生根际中参与硫化氢(H2S)和亚硫酸盐合成的基因下调(图3)。参与合成铁载体的基因也有所下调，例如：acyl-homoserine-lactone acylase [EC:3.5.1.97] 和 diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase [EC:2.6.1.76], 4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase [EC:1.14.13.2] 以及 chitinase [EC:3.2.1.14] (图3)。生长素IAA，是由色氨酸通过三种通路合成的，分别是：吲哚丙酮酸( indolepyruvate)、色氨酸(tryptamine)或indole-3-acetamide途径。一些编码吲哚-3-乙酰胺和吲哚丙酮酸的基因，在连作花生根际显著下调，例如：aldehyde dehydrogenase[EC:1.2.1.5]、nitrilase[EC:3.5.5.1]、tryptophan 2,3-dioxygenase[EC:1.13.11.11]、indolepyruvate ferredoxin oxidoreductaseEC:1.2.7.8。Trp聚类基因和色氨酸合成的基因，也存在下调现象，如anthranilate synthase [EC:4.1.3.27]和 tryptophan synthase [EC:4.2.1.20]。近期研究表明挥发性化合物羟基丁酮(acetoin)和2,3-丁二醇通过刺激根的形成直接影响植物的生长。有趣的是,在连作花生根际，参与编码羟基丁酮的以下基因均下调，如pyruvate dehydrogenase[EC: 1.2.5.1],alcohol dehydrogenase[EC: 1.1.1.2],diacetyl reductase[EC: 1.1.1.4 1.1.1.-1.1.1.303], S-(hydroxymethyl) glutathione dehydrogenase[EC: 1.1.1.284 1.1.1.1],和hydroxyphenylpyruvate dehydrogenase[EC: 1.13.11.27]。
连作土壤抑制了植物的生长
Lower plant performance in the monocropped than in rotation soils
与轮作土壤相比，连作土壤抑制了花生植株的生长，但不会使植株发病，例如株高、根长、地上部重量和根重均比轮作花生低得多(图4a)。若将花生植株种植在蛭石上，并接种轮作土和连作土的细菌悬液，也会得到类似的结果(图4b)。
图3 不同处理影响了基因的表达水平，从而影响了植物的生长。倍数变化定义为(MP-RP)/MP，其中MP为连坐土中的基因表达水平，RP为轮作土中的基因表达水平。绿色代表连坐花生根际基因表达量下调;红色代表连坐土壤花生根际基因表达量上调。
Comparative transcriptome analyses of peanut roots
比较花生根部转录组
热图显示，在连作和轮作土壤中，花生基因的表达方式有着明显差别(图5a)。植物激素不仅是植物生长发育的必要物质，并且影响着宿主与微生物的相互作用。因此，我们评估了一些编码合成植物激素基因的表达情况，这些基因有：合成生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)、脱落酸(AA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等基因(图5b)。此外，根据转录组数据显示，在连作花生中，一些合成生长素的基因被发现下调，这些基因有auxinresistant1 (AUX1), AUX/IAA, auxin response factor (ARF)和small auxin-up RNA(SAUR)(图5b)。在细胞分裂素途径中，A-ARR和B-BRR转录因子基因显著下调，而编码GID1和参与有关赤霉素信号传导的基因显著上调。相反，大多数来自SA、JA和ET信号通路的基因以及编码AA合成转录抑制因子的ABF基因均会上调(图5b)。此外，在连作花生中，许多植物对细菌的响应基因都会上调，包括鞭毛蛋白(flagellin)和EF-Tu(补充图5)。然而，多数与真菌病原体应答相关的基因，其表达量并没有明显改变。连作花生中，参与谷氨酸合成的部分基因(如GLU2)下调(补充图S5)，而许多参与isoflavonoid、phenylpropanoid合成的基因表达均上调(补充表S5)。
图4a 连作土的花生生长状况明显劣于轮作土。图4b 从连作土壤中提取的菌悬液也会抑制花生的生长。MP表示花生生长在连坐土壤中;RP表示花生生长在轮作土壤中。给出了三次重复的均值和标准差。*表示连作和轮作土壤样品变量的均值有显著差异(p<0.05)。
讨论
在影响植物生长和健康方面，根际微生物群落被广泛研究，并且大多数研究关注有益细菌对植物的影响。然而，我们知道农艺活动对根际微生物群落的组装的影响会导致作物产量受到影响，并且就这方面的研究也是必要的。在本研究中，我们使用宏基因组测序来描述不同耕作制度下，花生根际微生物群落的组成变化以及潜在功能变化。表明，在连作花生的根际，稀有物种比非优势物种和普通物种的含量要高。这说明花生连作增强了某些微生物物种在花生根际的定植能力。为了揭示微生物群落改变 背后的潜在影响因素，我们使用转录组对花生基因表达特征进行分析。表明，连作花生土壤中聚集的微生物群落可能抑制了花生激素的信号传导过程。植物特定的根系分泌物可驱动和塑造根际微生物群落。目前的研究表明，耕作历史或作物品种会对花生植株根际群落产生一定的影响。许多研究一致表明，农艺活动会影响根际微生物群落。轮作时，由于寄主植物与其他作物品种交替种植，这或许会使前一种作物产生选择效应，造成土壤中某些微生物丰度下降。相反，连作会反复将相同的根系分泌物释放到土壤中，从而促进某些微生物物种在根际的定植。例如K. racemifer, Burkholderiaspp.和O.terrae，会优先利用特定的根系分泌物，并在连作花生根际高度富集。这表明植物会招募有分解根系分泌物能力的菌群。然而，某些细菌相对丰度的增加将涉及资源和空间的竞争问题。在本研究中，我们发现连作花生根际有着相对丰富的能量代谢通路，如肌醇磷酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及各种糖降解途径(补充图S2a)。重要的是，我们也观察到了细菌趋化和核苷酸切除与修复功能等功能富集，这些功能与植株根际竞争力有关。
图5a 热图显示了不同基因在连作和轮作土壤中的表达规律。颜色条表示log10 (RPKM)值，范围从绿色(−4.0)到红色(4.0)。图上部为基因树、右测为样本树。
图5b 花生植物激素信号通路基因的表达分析。彩色的方框表示单个基因的表达，右侧图中的热图表示连作处理土壤中花生相对于轮作处理土壤中花生的通路基因表达水平。绿色框表示下调基因;红色框表示上调基因。
我们利用宏基因组将与植物生长发育相关的根际微生物群落的结构和功能联系起来(补充表S4)。与轮作相比，连作根际的特有的基因丰度较低，减少了花生的生物量(图3)。同时，从近年来对拟南芥和大豆根际功能特性的研究来看，矿物质的代谢对植物生长具有重要意义。目前在酸性土壤的研究中，有效的可溶性磷酸盐和有效氮会抑制植物的生长。我们观察到花生根际参与氮素代谢的基因会在连作处理中下调，同时，可溶磷酸盐和硫的循环途径受阻；根际合成植物激素(这些化合物都通过刺激根的分枝和伸长来促进植物生长)的功能显著减弱，包括IAA、乙酰乙酸和2,3-丁二醇等。我们还观察到，连作花生植株生长缓慢。不同耕作制度植株招募不同的根际微生物群落，并且有着不同的植物表型。这些结果共同表明了微生物可能是联系耕作制度同植物表型的纽带。化感物质在土壤中的积累可能对连作体系植株生长有负面影响，但是我们的研究发现了不同的现象。首先是我们盆栽使用的土壤在连作过后的八个月，那个时候易挥发的化感物质（通过微生物分解，等）在土壤中的含量可能达不到对植物的致毒计量；其次，我们使用土壤悬液做验证试验，其中残留很少的化感物质，更可能是微生物在其中起着重要作用。事实上，这一现象支持我们的假设：植物分泌化感物质，并通过化感物质招募不同的微生物群落，反馈到植物，导致植物拥有不同的表型特征。因此，更多的工作应该关注在化感物质同微生物群落和植物之间的相互关系。
然后，我们使用转录组测序来比较连作和轮作土壤中花生植株的基因表达情况。结果表明，与植物激素合成的有关通路参与了植物根际微生物群落与花生植株的相互作用。参与调控生长素、细胞分裂素、AA、SA、JA和ET合成途径的基因可能是连作土壤中植物生长受阻的原因。例如：在连作花生土壤中与类黄酮生物合成相关的基因上调，这一现象可能与激素合成的相关基因(如生长素和细胞分裂素)下调有关。众所周知过量的AA、SA、JA和ET等会抑制植物的生长。作为一种豆类，我们观察到了不同耕作历史会影响花生根瘤的形成。根据许多研究报道，植物生长素平衡发生改变是根瘤形成的先决条件。在本研究中，控制连作花生分泌生长素的基因表达量降低(GH3、AUX1)，这可能会影响花生根瘤的形成(因为这些基因的表达是根瘤形成所必需的)。此外，有几项研究还报道了SA、ET、JA和AA信号会对根瘤菌感染率和结瘤率以及结瘤强度造成的负面影响。因此，植物激素信号的变化可能会导致连作花生土壤中花生根瘤数量减少；另一方面，激素信号的改变可能降低根瘤菌的定植率，因为结瘤十分依赖于植物碳水化合物提供的能量。总之，我们的结果为优化宿主-根瘤菌共生的机制提供了一些线索。因此，我们需要进一步研究连作对花生根瘤的形成、对根瘤菌共生行为及其遗传途径所产生的影响。
此外，植物根系调控的与微生物相关的分子过程对根际微生物的定殖起着重要作用，但对病原菌致病性方面的作用不大。众所周知的例子是细菌鞭毛蛋白和EF-Tu。事实上，在本研究中观察到连作花生体系下细菌运动相关的基因上调，但对真菌对应的相关的基因没有应答。这表明，与轮作相比，连作增加了一些细菌的生存压力。
结论
我们对宿主相关微生物群落进行宏基因组分析，阐明了根际微生物群落功能的重要性。我们的研究揭示了耕作历史会对当前作物根际微生物群落产生重要影响，并且根际微生物群的组装与植物的表型密切相关。连作后，因控制合成植物激素的基因发生了调动，影响了激素的分泌，从而驱动了同类根际微生物种群在根际的富集，导致土壤的微生物群落功能的下降，致使植物表型发生变化。总而言之，本研究阐述了土地利用历史对植物表型的影响，为将来通过选择特定的根际微生物类群以提高植物的性能提供理论依据。
材料方法
田间实验处理
Field trial and treatments
实验田位于在中国江西省中科院(28°130′ N, 116°550′ E)。这块试验田于2011年8月开始休耕，隔年6月，我们将该块试验田分割为6块(每块大小6m×10m；且我们随机排列了这6块试验田)，它包含了2种处理以及3个重复:Ⅰ.种植花生(连作);Ⅱ.第一年种植花生第二年种植其他作物，由此往复(轮作)。在品种选择上，连作处理的试验田中，我们持续种植了4季(2012-2015)花生(Ganhua-5)；在轮作处理的试验田中，我们在第一年和第三年种植花生，在第二年和第四年分别种植玉米(Zea mays L.)和马铃薯(Solanum tuberosum)。每块试验田都是在4月播种，并在当年8月完成收获，随后休耕到第二年4月才继续播种。常用农田管理的人工操作包括：耕作、施肥和除草。实验设计在(图1)中进行了总结，在补充材料方法中有描述了种植细节。试验田的土壤为地丘红壤(FAO 1998 classification)，并在表S1中对其理化性质进行了补充。
图1 本研究主要实验的流程图：a.选区试验田的地点。b.两种处理方法图解。c.在2016年种植季节开始时，随机抽取6个地块的土壤样品(0-20cm层)，进行盆栽试验。每一块地的土壤被转移到五个种植花生的花盆里。d.在收获时，从每块田的5个盆中收集植物和根际土壤样本。(a-d的详细说明见“田间实验处理”)e.分析。
花生幼苗盆栽实验
Peanut seedling cultivation in a pot experiment
在2016年播种前，我们在每块试验田(共6块)上随机取样30kg土壤(在土体表面0-20cm处)，并去除植物残体将其均匀混合(图1)。每块试验田都有5盆土壤(每盆均盛有3kg随机取样的土壤样品)，并且每盆都要接种消过毒的花生种子(Ganhua-5)。因此，6块试验田，每块田有5个生物学重复，共30个实验小区(5盆×3种重复×2种处理)。经过30天的种植，通过收获，我们将根际土壤小心的收集起来，并且混合每块试验田的根际土壤。因此，连作和轮作处理都会有3个独立重复的土壤样品可用于后续分析(图1)。
我们从土壤中分离了花生根系，并用蒸馏水冲洗它们。我们将所有感病植株的根系以及花生的根际土样用液氮速冻，保存于-80℃，用于后续的下游分析。后面我们用“连作花生”和“连作花生的根际”( “monocropped peanut rhizosphere”),来表示连作处理，用“轮作花生”和“轮作花生根际( “rotation peanut” and “rotation peanut rhizosphere”)来表示轮作处理。
微生物对植物表型影响实验
Determination of plant growth responses to bacteria extracted from the field soils
评估植物生长对土壤微生物群落响应的细菌悬液：从每一块试验田中均取5g干土与50ml无菌水混合，并放置在200rpm的摇床上，震荡1h，用47kHz超声2次，再震荡0.5h。之后，用5μm的滤膜滤掉悬液中大部分的真菌。所以，我们一共制备了6种细菌悬液(2种处理3个重复)。我们对Li等人的方法进行了轻微的修改，在无菌条件下培育花生幼苗。首先，按照补充材料中的方法对花生种子的表面进行消毒。然后，在装有无菌蛭石和50ml无菌霍格兰营养液(1\4浓度)的200ml烧杯中种植一株生长良好、未感病的幼苗。将4个种有植株的200ml烧杯共同放入一个5L的烧杯中，并在5L烧杯上覆盖四层无菌纱布(防止微生物污染),将其放置在植物生长室中进行培养(温度为30°C,相对湿度为70%，光照强度为500μMm-2s-1)(图.4b)。经过7天的培育，我们将两种处理的菌悬液取5ml加到蛭石中；对照组则加入5ml无菌水。每块试验田都会用4株花生幼苗(用该块试验田菌悬液培育的幼苗)来代表。
花生根系微生物的宏基因组分析
Metagenomic DNA analyses of the peanut rhizosphere community
为了能够获得足够的DNA(每个样品2μg)，我们从根际样品中提取4-6份加入到 FastDNA SPIN 试剂盒中；采用美国Thermo Scientific公司的NanoDrop测定DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性；同时利用Covaris M220(Thermo Scientific, USA)制备约300bp的DNA文库，并用Illumina Hiseq 4000仪器(Illumina,USA)进行测序。产生了30Gb的数据，平均读长为151bp(补充图表S2)。我们在3’端利用FASTX保留了读长为20bp~50bp的高质量的序列(＞97.1%)用于下游分析。宏基因组和蛋白编码基因的组装如前所述。利用USERCH(E<1×10-5)将所有目录里的DNA都翻译为氨基酸序列，并与KGGE中v59的数据库进行比对，并将KGGE中的同源基因与蛋白质序列匹配。我们利用特定的注释基因丰度之和来预测同源基因的丰度，并利用MG-RAST服务器，以最佳氨基酸序列为模板，估算了微生物分类群基因组的相对丰度。
花生的宏转录组测序分析
Peanut plant metatranscriptome analysis
利用Trizol®试剂((Invitrogen, Carlsbad， USA),将RNA从花生幼苗的根部提取出来。用安捷伦2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)测得样品平均的RNA完整指数(RIN)为8.1(补充图S1)。利用磁力搅拌的方法将mRNA从总RNA中分离出来，并将其破碎至200bp。将这些mRNA片段作为模板，利用由逆转录酶启动的随机六聚体反应，合成cDNA。采用上标双链cDNA合成试剂盒合成双链cDNA。然后使用QIAquick PCR提取试剂盒(Qiagen，德国)纯化cDNA，并在末端修复poly(A)，与测序适配器连接。按说明书讲解，在Illumina HiSeq 4000平台(Illumina, USA)上进行测序。比对SOAPdenovo中的Arachis ipaensis基因组序列，丢弃低质量的原始序列，并从每个库中收集干净的序列。A.ipaensis基因组数据从NCBI数据库中下载。计算参考基因reads的分布，利用比对数据进行覆盖率分析。基因表达水平通过RNA测序(RNA测序-seq)，并使用Cuffdiff按M映射读取每kb的外显子模型(RPKM)。利用Cuffdiff算法确定差异表达基因所对应的p值。根据每个样本归一化后的基因表达量，确定表达量的折线变化(如log2比值)。以错误发现率(FDR) >0.001的阈值和log2比值>3的绝对值来判断各处理间基因表达量的差异。我们为了确定不同处理中差异明显的通路，进行了KEGG富集分析(q值<0.05表示基因组明显富集)。
统计分析
利用STAMP软件对数据进行统计分析，来鉴别连作和轮作花生根系微生物群落组成的差异。利用Welch的t检验(p<0.05)显著性检验测定根际微生物组成和代谢通路间的联系，并用Newcombe–Wilson模型估计置信区间。我们通过R中的”vegan”包测定Shannon多样性；利用主坐标分析(PCoA)生成的分类和功能丰度矩阵，对样品的群落结构进行可视化；使用PAST的软件生成所有样本的Bray-Curtis相似度矩阵，做出PCoA图；采用单因素方差分析方法，研究了土壤类型对微生物组成和功能多样性产生的影响。我们用KGGE的同源序列进行基因功能分析，采用Wilcoxon的秩检验各组间的丰度差异，并对多次测试的p值进行了修正。以KGGE同源通路作为报告特征算法的指标，计算差异显著的KEGG的报告通路。根据KEGG同源序列的p值对每个通路进行评估，并根据变化倍数去计算每个通路的总p值。我们通过对注释基因的检测，确定了调控某些物质合成过程的基因，这些过程往往影响着植物的生长，他们包括即吲哚乙酸(IAA)的合成;磷酸盐(phosphate)的溶解;铁素体、乙酰胆碱(acetoin)和2,3-丁二醇(2,3-butanediol)的合成;抑制真菌病原体的产生以及抗氧化应激反应和氮、硫的代谢过程等(补充表4)。在花生转录组KEGG通路分析中，KOBAS检测了通路中所有表达有差异的基因，并绘制成热图以揭示其共同的表达模式(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)。
登录号
花生根际群落基因组原始序列数据和RNA-Seq reads 分别以SUB4375926和SUB4426379为登录号存储在GenBank数据库中。