科研 | 北京林业大学：利用转录组和靶向代谢组学解析不同发育阶段的金银花色素沉着（国人1区作品）
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Transcriptomics and targeted metabolomics profilings for elucidation of pigmentation in Lonicera japonica flowers at different developmental stages
译名：利用转录组和靶向代谢组学解析不同发育阶段的金银花色素沉着
期刊：Industrial Crops & Products
IF：4.191（1区）
发表时间：2019.11.11
通讯作者：刘玉军
通讯作者单位：北京林业大学
DOI号：10.1016/j.indcrop.2019.111981
实验设计
收集金银花6个发育阶段的花：幼蕾期（S1，绿色花蕾），三青期（S2，青绿色花蕾），二白期（S3，绿白色花蕾），大白期（S4，白色花蕾），银花期（S5，花初开，白色）和金花期（S6，黄色开放花），将90朵均匀的花朵分为三组，进行3次生物学复制。利用分光光度法测定总花青素、叶绿素、和类胡萝卜素。对样品进行转录组测序分析后从头组装，进行基因的功能注释和差异表达基因（DEG）的鉴定，利用qRT-PCR验证DEG结果。通过与植物转录因子数据库进行比对鉴定转录因子（TF），并利用WGCNA软件包从已鉴定的DEG和TF构建基因共表达网络，以建立花青素生物合成、叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成的转录网络。
对类胡萝卜素进行靶向代谢组学研究，通过从S1、S4和S6中提取类胡萝卜素，通过超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UPLC-ESI-MS / MS）分析18种类胡萝卜素的含量，用于与转录组共同分析其不同发育阶段的花色沉着的机制。
结果
1总花青素，叶绿素和类胡萝卜素含量的动态变化
在金银花的花发育过程中，花的颜色从最初的绿色变为白色，然后变为黄色（图1D）。为了阐明这些生理和/或色素沉着的变化，在六个开花阶段检测了总花青素、叶绿素和类胡萝卜素（图1A–C）。花青素含量从S1到S3急剧下降，在S3–S6均未检测到（图1A）。在S1和S2积累的总叶绿素在S3显著下降，在S4–S6进一步下降（图1B）。总类胡萝卜素含量从S1下降到S5并在S6达到峰值（图1C）。因此，早期的绿色主要是由于叶绿素的积累。在S1和S2处也检测到花青素和类胡萝卜素，表明存在不可观察的颜色。S3-S5处的白花主要归因于三种色素的浓度非常低。高浓度的类胡萝卜素导致S6的黄色花朵。
图1.金银花在六个开花阶段的色素沉着和表型。（A）总花青素，以花青素-3-葡萄糖苷为总花青素的标准；（B）总叶绿素；（C）总类胡萝卜素；（D）花的表型；S1-S4，绿色，略带白色和全白色花蕾；S5和S6，银色和金色花朵。
2转录组测序、DEG注释和分析
为了检测金银花S1–S6期花的基因表达谱，构建并测序了18个cDNA文库。原始序列数据已保存在组学原始数据归档库(Genome Sequence Archive)，登录号为PRJCA001536（http://bigd.big.ac.cn/gsa）。利用公共数据库（NR、eggNOG、Pfam、Swiss-prot、GO、KOG、COG和KEGG）对组装的的基因进行注释。将13299个独立基因定位到130个KEGG通路。值得注意的是，花青素生物合成涉及27个基因，叶绿素代谢涉及52个，类胡萝卜素生物合成涉及44个。至少鉴定出了8430个差异表达基因（DEG）。将S2与S1、S3与S2、S4与S3、S5与S4和S6与S5比较（图2A）。发现S3vsS2的DEG数量最多（5615），在S3中分别有3160和2455个基因上调和下调（图2B和图1D）。相反，在S4 vs S3中观察到最少数量的DEG（53），在S4分别有25个和28个独立基因上调和下调（图2B和图1D）。
图2.五个成对比较中差异表达基因（DEG）的分布。（A）通过成对比较得出的DEG数量的维恩图。（B）成对比较中DEG的数量。S1-S4，幼，绿色，略带白色和全白色的花蕾；S5和S6，银色和金色花朵。
3与花色素沉着有关基因的表达方式
3.3.1花青素生物合成相关基因
在金银花的花发育过程中，花青素在S1和S2处积累（图1A）。转录组学分析，鉴定出27种独立基因编码的11种假定酶参与花青素生物合成，其中11种是DEG。除CHS1和CHS6外DEG均在S1处表达最高；此外，与S1-S2相比，CHS1、CHS3、CHS5、F3H、CYP75B1、DFR和ANS在S2的表达更高，而在S3-S6的表达却非常低。以上结果解释了总花青素含量从S2到S3降低的原因（图1A）。此外，尽管CHS6的表达在S5处最高，但其FPKM值（5.51）却非常低。对其中5个DEG进行qRT-PCR分析，其表达趋势（图4A–E）与其相对丰度（图3A）一致。
3.3.2叶绿素代谢相关基因
褪绿是金银花开花期间发生的重大变化。与叶绿素代谢相关的52个基因中存在16个DEG（图3B）。在参与叶绿素合成的14个DEG中，S1期HEMA1等11个表达明显高于其他阶段，并且HEMB和HEMC的表达在S6达到峰值。相反，2个DEG与叶绿素降解有关。对8个DEG进行qRT-PCR验证发现其表达趋势（图4F–M）与其相对丰度（图3B）一致。
3.3.3类胡萝卜素生物合成相关基因
在S6的金银花的花中类胡萝卜素的大量积累导致外观发生明显变化（图1C）。鉴定得到44种类胡萝卜素生物合成相关的基因，其中20种是DEG（图3C）。PSY1-1等大多数DEG在S6处高表达，LCY-ε等5个在S1高表达。对10个DEG进行qRT-PCR验证发现其表达趋势（图4N–W）与其相对丰度一致（图3C）。
图3.与花青素生物合成（A）、叶绿素代谢（B）和类胡萝卜素生物合成（C）相关的差异表达基因（DEG）的热图。S1-S4，幼，绿色，略带白色和全白色的花蕾；S5和S6，银色和金色花朵。每个子图最左侧的斜体字代表编码相应蛋白质的基因。斜体字后面的数字（即c105533.graph_c3）表示转录组中的基因序列号。使用热图，颜色越绿色，DEG表达水平越高，而颜色越红，DEGs表达水平越低。CHS，查尔酮合酶；F3H，黄烷酮3-双加氧酶；CYP75B1，类黄酮3'-单加氧酶; DFR，二氢黄酮醇-4-还原酶； ANS，花青素合酶；GluRS，谷氨酰-tRNA合成酶；HEMA，谷氨酰-tRNA还原酶；HEMB，胆色素原合酶；HEMC，羟甲基胆碱合酶；HEMD，尿卟啉原-III合酶；HEME，尿卟啉原脱羧酶；HEMF，原卟啉原Ⅲ氧化酶； HEMY，原卟啉原/原卟啉原III氧化酶；HEMG，依赖甲萘醌的原卟啉原氧化酶；CHLD，镁螯合酶亚基D；CHLH，镁螯合酶亚基H；CHLI，镁螯合酶亚基I；CHLM，镁原卟啉O-甲基转移酶；CRD，镁-原卟啉IX单甲酯（氧化）环化酶；POR，原叶绿素还原酶； DVR，二乙烯基叶绿素一8-乙烯基还原酶；CHIG，叶绿素/细菌叶绿素a合酶；CAO，叶绿素加氧酶；NYC1，叶绿素（ide）b还原酶；CLH，叶绿素酶；PaO，脱镁叶绿酸加氧酶；RCCR，红色叶绿素分解代谢物还原酶；PSY1，八氢番茄红素合酶；PDS，八氢番茄红素去饱和酶；ZDS，ζ-胡萝卜素去饱和酶；ZISO，ζ-胡萝卜素异构酶；CRTISO，番茄红素异构酶；LCY-ε，番茄红素ε-环化酶；LCY-β，番茄红素β-环化酶；crtZ，β-胡萝卜素3-羟化酶；DWARF27，β-胡萝卜素异构酶；ZEP，玉米黄质环氧酶；VDE，紫黄质脱环氧化酶；CCS1，辣椒红素/辣椒红素合酶；NCED，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶；ABA2，黄嘌呤脱氢酶；AAO3，脱落醛氧化酶。
图4. qRT-PCR分析6个开花阶段金银花中23种色素沉着相关候选独立基因的表达。在每个子图中，基因名称的前两个字母“ Lj”表示忍冬（Lonicera japonica），后两个字母代表编码相应蛋白质的基因。每个基因名称下面的数字（即c80220.graph_c0）表示转录组中的基因序列号。CHS，查尔酮合酶；F3H，黄烷酮3-双加氧酶；CYP75B1，类黄酮3'-单加氧酶; DFR，二氢黄酮醇-4-还原酶；ANS，花青素合酶；HEMA，谷氨酰-tRNA还原酶；HEMD，尿卟啉原-III合酶；HEMF，原卟啉原Ⅲ氧化酶； CHIH，镁螯合酶亚基H；CRD，镁-原卟啉IX单甲酯（氧化）环化酶；POR，原叶绿素还原酶；PaO，脱镁叶绿酸加氧酶；PSY1，八氢番茄红素合酶；PDS，八氢番茄红素去饱和酶；ZDS，ζ-胡萝卜素去饱和酶；LCY-ε，番茄红素ε-环化酶；LCY-β，番茄红素β-环化酶；crtZ，β-胡萝卜素3-羟化酶；DWARF27，β-胡萝卜素异构酶；ZEP，玉米黄质环氧酶；VDE，紫黄质脱环氧化酶；CCS1，辣椒红素/辣椒红素合酶。S1-S4，幼，绿色，略带白色和全白色的花蕾； S5和S6，银色和金色花朵。
3.4．与花青素生物合成、叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成相关的调控网络的构建
3.4.1．转录因子TF的识别和WGCNA模块的建立
共鉴定出41个TF家族的298个TF。其中，最多的是bHLH TF家族（34个），其次是ERF（29 TF个）、C2H2（28个）、MYB（25个）和NAC（21个）家族。使用WGCNA构建了共表达基因网络模块。如图5A所示，合并得到10个模块，棕色模块包含11个与花青素生物合成相关的DEG中的9个和16个叶绿素代谢相关的DEG中的8个，这表明棕色模块中的独立基因在花青素的积累和叶绿素代谢中起重要作用。黑色模块中数量最多的类胡萝卜素生物合成相关的DEGs，表明它参与了金银花花中类胡萝卜素生物合成的调节。
进一步分析了模块与特征之间的关系（图5B）。结果表明，棕色模块与S1性状显著相关，红色模块与S2性状相关，黑色模块与S6性状显著相关，表明棕色、红色和黑色模块中的独立基因分别对S1，S2和S6的性状做出了重要贡献。但是，没有模块与S3、S4和S5的性状显著相关。其中苯丙烷类生物合成和类黄酮生物合成是与棕色模块中S1相关的关键途径，淀粉和蔗糖代谢以及氨基糖和核苷酸-糖代谢是关键红色模块中与S2相关的信号通路，萜类骨干生物合成和类胡萝卜素生物合成是黑色模块中与S6相关的关键途径。
3.4.2.监管网络的建设
为了确定与花香中花青素生物合成、叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成有关的调控基因，利用棕色和黑色模块中9个花青素生物合成相关DEG，8个叶绿素代谢相关DEG和6个类胡萝卜素生物合成DEG构建了三个子网。花青素合成和叶绿素代谢的调控网络共有17个TF家族的21个TF，其中bHLH（3个独立基因）、C3H（2个独立基因）和FAR1（2个独立基因）最大（图6A–B）。此外，还发现了12个TF家族中的18个TF（图6C）来调节类胡萝卜素的生物合成。在TF家族中，bHLH（3个独立基因）最大，其次是MYB（2个独立基因）、C2H2（2个独立基因）、C3H（2个独立基因）和B3（2个独立基因）。此外，还评估了TF与靶基因之间的连接强度（图6）。
在21个TF中，有13个参与了F3H（c105930.graph_c3）的调控（图3A；图6A），表明F3H是花青素生物合成调控网络中的关键靶基因。在这13个TF中，C3H家族的TF（C3H14）与F3H的联系最紧密（图6A）。另外，在21个TF中，有18个参与了结构基因CLH（c96829.graph_c1）的调控（图3B），这表明CLH是叶绿素代谢调控网络中的关键靶基因。有趣的是，这21个TF中的C3H14也与CLH具有最强的联系（图6B）。同样，类胡萝卜素生物合成调控网络中的所有18个TF都调控结构基因NCED3（c85609.graph_c1）（图3C），其与18个TF中的B3家族成员REM39最紧密的联系（图3C，图6C）。
图5.金银花六个阶段的差异表达基因（DEG）的WGCNA模块的建立。（A）通过拓扑重叠不相似性的分层聚类获得的6245个DEG的树状图。6245个DEG都由分支中的叶子表示。两个基因之间的共表达距离显示为y轴上的高度。树状图下方的第一行和第二行分别指示通过动态树剪切方法和具有0.85合并阈值的合并动态树标识的模块成员。主要的树枝构成10个不同的共表达模块。（B）模块特征基因（ME，行）与六个阶段（列）的性状之间的关系。颜色根据右侧的颜色图例指示相关的强度和方向。括号中的数字是部分皮尔逊相关性和相应的P值。S1-S4，幼，绿色，略带白色和全白色的花蕾；S5和S6，银色和金色花朵。
图6.花青素生物合成、叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成调控网络的构建。 （A和B）分别与棕色模块中花青素生物合成和叶绿素代谢有关的假定转录因子（TFs）和结构基因的子网络；（C）与黑色模块中类胡萝卜素生物合成相关的假定TF和结构基因的子网。红色圆圈表示靶基因，绿色圆圈表示TF。两个点之间的线表示它们正在相互作用。线条的颜色表示目标基因和TF之间的相关强度，即，TF和目标基因之间的相互作用越强越红，越弱越蓝。
3.5. S1、S4和S6的金银花花中的类胡萝卜素分析
为了探讨不同开花阶段金银花中类胡萝卜素的积累模式，对S1、S4和S6处的花朵进行了有针对性的UPLC-MRM-MS / MS分析。表3列出了18种类胡萝卜素的分子量、保留时间、Q1 / Q3对和KEGG ID及其在S1、S4和S6处的积累。在S1和S4期发现了9种类胡萝卜素，S6发现了13种类胡萝卜素。所有样品未检出四种类胡萝卜素（六氢番茄红素、八氢番茄红素、β-隐黄质和辣椒素）。18个类胡萝卜素的总含量在S6时明显更高，其次是S1和S4。与分光光度法测定总类胡萝卜素吻合。
色谱图显示，S1处的主要类胡萝卜素为叶黄素、玉米黄质、紫黄质和新黄质。α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和玉米黄素的总含量占13种类胡萝卜素总含量的79.6％。在S6，这3种类胡萝卜素是金花的主要成分。
主成分分析（PCA）表明根据类胡萝卜素的特征可以将金银花的三个开花阶段进行区分，这表明类胡萝卜素的特征在发育阶段存在显著差异（图7A）。在图7中（图7B），显示了四个类胡萝卜素位于原点，表示在S1，S4和S6处的含量为零。S1位于分数散点图的第一象限，其特征在于较高的黄嘌呤、叶黄素和ε-胡萝卜素含量（图7A、图7B）。在第四象限中未发现S4的特征类胡萝卜素S4（图7B）。S6的特征是花药黄质、辣椒红素、黄质黄质、脱辅基胡萝卜素、α-胡萝卜素、玉米黄质、α-隐黄质、γ-胡萝卜素和番茄红素含量高，位于第二象限（图7A）。
图7.金银花在S1、S4和S6的类胡萝卜素的定量数据的PCA分数散点图（A）和负载散点图（B）。S1：初期花蕾； S4：全白花蕾；S6：金黄色的花朵。
讨论
之前研究中利用RNA-seq对金银花进行的转录组研究都集中于生物合成活性成分的差异，本研究首次对花期不同颜色变化，使用大量的样品及大规模转录组数据，对6个发展阶段中进行了三个生物学重复的的全局转录组分析，以研究与花色有关的转录模式变化，将有助于研究多色花品种以及忍冬属中其他几个品种的繁殖以及目的基因或蛋白质的功能表征。
花青素是通过类黄酮途径合成的，其基因被分为双子叶植物的早期和晚期生物合成基因。本研究鉴定了11个与金银花花青素生物合成途径相关的11个DEG，其中早期9个和晚期2个，几乎均在S1和S2处高表达，但在S3–S6中以极低的水平表达，表现出表达水平与花青素浓度正相关（图1A，3A）。结果还表明，花青素不参与S3至S6的花色变化。同时本研究鉴定了21个TF与9个花青素生物合成相关的DEGs共表达，其中R2R3-MYB（c100940.graph_c0）和3个bHLH（c102574.graph_c0; c103000.graph_c2; c103392.graph_c0）TFs与4个花青素生物合成相关的DEG正相关（图6A）。MYB基因（c100940.graph_c0）与F3H正相关（图3A），MYB基因是AtMYB15的直系同源物，与植物的胁迫耐受性有关。与CYP75B1正相关的基因c102574.graph_c0的序列（图3A）与bHLH家族的AtTT8的序列相同，后者参与拟南芥中花青素生物合成基因的调控，表明可能通过作用于CYP75B1来调节金银花中的花青素生物合成。这些结果表明，WGCNA是鉴定与特定途径相关的TF的有力方法。
在金银花花中，与叶绿素代谢相关基因中16个差异表达，其中大多数在S1时被上调，在后期被下调，与叶绿素的含量密切相关（图1B；图3B）。相反，PaO（c109265.graph_c0）（图3B）是一个参与叶绿素降解的基因，在S3、S5和S6处显示较高的表达。总之与叶绿素降解相关的基因的高表达和与叶绿素生物合成相关的基因的低表达解释了S4–S6中不存在叶绿素。
包括已知参与叶绿素代谢的bHLH、FAR1和NAC家族等17个TF家族的21个TFs与8种叶绿素代谢相关的DEGs共表达（图6B）。WGCNA表明其他14个家族（例如C3H、ERF、B3和MYB家族）的TF也参与了金银花花中的叶绿素代谢。这些数据将有助于阐明金银花花中叶绿素代谢的分子机制。
在本研究中，参与类胡萝卜素生物合成途径的44个基因中有20个差异表达，其中表达增加的DEGs数量最多的是S6，其次是S1（图3C），代谢水平上类胡萝卜素在S6最高，其次是S1和S4（表3），与比色分析的结果（图1C）和相关DEG的表达水平（图3C）一致。这表明，由于高浓度的类胡萝卜素导致金银花花的黄色，类胡萝卜素也参与了早期的花色形成。
基因水平上PSY-1-1、PSY-1-2、PDS、ZDS、crtZ、CCS1、NCED3和AAO3与类胡萝卜素含量呈高度显著正相关。相反，NCED2、NCED5和ABA2与总类胡萝卜素含量呈显著负相关。除此之外ZDS等基因也可能在金银花花的类胡萝卜素生物合成中起关键作用。
ε-和β-支链产物的平衡受LCY-ε和LCY-β活性的影响，决定了几种植物的类胡萝卜素组成（图3C）。在金银花花中，S1的LCY-ε水平较高，可能是叶黄素浓度升高的原因（图3C）。然而，叶黄素的上游中间体α-胡萝卜素在S6积累，表明α-胡萝卜素转化为叶黄素可能被S6的其他基因阻止，导致中间代谢物流向各种其他类胡萝卜素（例如β-胡萝卜素和β分支上的α-隐黄质）（图3C）。这将导致其含量增加，颜色从银变成金，从而解释了金银二色性花的起源，即所谓的金银花。
TF可能参与调节几种植物类胡萝卜素生物合成中涉及的结构基因的表达，然而，尚未有关于与金银花中类胡萝卜素生物合成有关的TFs的研究。本研究中， WGCNA鉴定得到与DEGs共表达的18个TF家族包括bHLH、MYB、C2H2和WRKY。这些数据将为研究TFs在金银花花中类胡萝卜素生物合成中奠定基础。
结论
综上所述，金银花的早期花色是由花青素和叶绿素引起的，晚期金花是由类胡萝卜素引起的，在14种可检测的类胡萝卜素中，金花的含量最高，其中α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和玉米黄质的总含量最高，占79.6％，是金花的主要成分。此外，还鉴定了可能是金银花花青素生物合成、叶绿素代谢和类胡萝卜素生物合成关键调节因子的TF。这些发现将对多色金银花的繁殖和目的基因或蛋白质的功能表征提供借鉴。
评论
对不同表型的生物进行转录组分析，可以对基因转录水平中进行宏观的分析，但往往能够获得的差异基因太多，分析验证困难，而且很多差异表达基因对表型不产生明显的作用，使研究的难度增加。代谢物是生命活动的最下游产物，直接反映了差异表达基因转录翻译造成的物质变化，因此利用代谢组学的方法，可以将转录组的差异基因与表型结合起来，更准确的鉴定及验证转录组的结果。非靶向代谢组学是对全部代谢物的检测，而靶向代谢组是针对目标明确的代谢产物进行检测，特别适用于某类结构和性质相似的化合物，可以进行准确的定性定量分析。本研究就是利用了类胡萝卜素相关化合物的靶向代谢组，对转录组结果进行验证，成功的对金银花色素沉着及变化的机制进行阐述，同时得到很多与色素相关的相关功能基因及转录因子，为其进一步研究基因功能奠定了基础。
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