科研 | Horticulture Research：基因表达图揭示交链孢霉感染不同时间阶段菊花叶片的防御机制（国人作品）

编译：young，编辑：十九、江舜尧。

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导读

由于气候条件适宜，并且目前缺乏温室栽培的抗性品种，菊花黑点病（CBS）对菊花的种植构成了重大威胁。在这项研究中，鉴定了许多在抗性和易感菊花品种中对链格孢菌感染有反应的基因。基于RNA测序技术和加权基因共表达网络分析（WGCNA），构建了一个模型，以阐明菊花叶在不同阶段对链球菌感染的反应，并比较了抗病品种“Jinba”与易感品种“Zaoyihong”的差异。在感染的早期阶段，当尚未形成病变时，脱落酸（ABA），水杨酸（SA）和EDS1介导的抗性在菊花防御系统中起着重要作用。随着坏死病灶的形成，乙烯（ET）代谢和Ca₂ ⁺信号转导途径强烈地响应了交链孢霉的感染。在晚期，当坏死病灶继续扩大时，多药和有毒化合物挤压（MATE）基因家族的成员得到了高度表达，其翻译产物可能参与防御病原菌侵袭，在交链孢霉的致病性中起重要作用。此外，通过qPCR和转基因测定法验证了关键基因的功能。鉴定不同阶段的关键基因，比较两个品种的关键基因和抗性品种“Jinba”中的高表达基因，为育种对CBS抗性的品种提供了理论基础。

论文ID

原名：A temporal gene expression map of Chrysanthemum leaves infected with Alternaria alternata reveals different stages of defense mechanisms

译名：基因表达图揭示交链孢霉感染不同时间阶段菊花叶片的防御机制

期刊： Horticulture Research

IF：3.640（农林一区）

发表时间：2020.3

通讯作者：陈发棣

通讯作者单位：南京农业大学菊花遗传育种与分子生物学实验室

DOI号：10.1038/s41438-020-0245-0

实验设计

从菊花种质资源保存中心获得了两个菊花品种（“Jinba”和“Zaoyihong”）和交链孢霉。幼苗在16小时的光照下生长，昼夜温度分别为25°C和18°C，相对湿度保持在〜70％。在液体培养基中培养交替链霉菌的菌丝体。从1 mL液体培养基中收集的菌丝体置于菊花叶上。接种后，菊花幼苗在黑暗中生长36小时。随后在接种后1、6、12、24和36小时对菊花叶进行采样。未接种的菊花叶用作对照（0 h），在实验开始时收集，然后接种。在规定的时间点收集到的被交链孢霉感染的叶片用于RNA测序，每种处理重复三次。进行了RNA提取和测序，并进行了DEG鉴定和GO富集分析，共表达网络分析以构建模块的构建和寻找关键基因，最后荧光定量验证转录组数据的准确性。进行了菊花CmWRKY33.1基因的遗传转化验证功能。

结果

链球菌霉接种后菊花品种的评价

选择了两个菊花品种，即“Jinba”（抗性品种）和“zaoyihong”（易感品种），它们在接种交链孢霉后的症状明显不同。接种后3天调查了两个菊花品种的黑叶斑病症状。 “Jinba（SM）”显示出坏死性病变，主要限于接种的叶子，而“zaoyihong（ZYH）”则显示了其他叶子上的坏死性病变，包括接种交链孢霉的叶子（图1a）。根据接种后3天患病叶子的比例评估病害症状；如图1b所示，患病的“Jinba”和“zaoyihong”叶片的比例分别为0.08–0.10和0.45–0.56。

根据表型，在六个时间点（0小时，1小时，6小时，12小时，24小时和36小时）对接种了交链孢霉的叶片进行采样，以分析“Jinba”和“zaoyihong”之间的转录水平差异，在每个时间点为每个品种采样三个生物学重复样本。

图1评估了两个菊花品种对菊花黑斑病（CBS）的响应。 a带有CBS的抗性品种“Jinba”和易感品种“zaoyihong”的图像。 b“Jinba”和“zaoyihong”中交链孢霉感染叶的患病比例

不同时间阶段样本中的DEG分析

为了研究两个菊花品种在交替链球菌后的转录差异时间动态变化，在每个接种时间点对未接种植物（SM_0或ZYH_0）的DEG数量（padj <0.05）与未接种植株进行比较。在'Jinba'品种中，5740（上调2835; 2905下调），19,691（12,176上调; 7515下调），13,805（8868上调; 4937下调），25,549（16,315上调; 9234下调）和25,375（15,543上调; 9732下调）在五个接种时间的样品中发现了基因差异表达；在'zaoyihong'中发现了7104（3352被上调; 3752被下调），12,010（7129被下调; 4881被下调），17,662（11,277被上调; 6385被下调），9813（7172被上调; 2641被下调）和18,826（11,816被上调; 7010被下调）DEGs被挑选出来。（图2a）。通过比较SM_24和ZYH_36鉴定出的阶段特异性基因数量最多（“Jinba”中为25,549，“zaoyihong”中为18,826），它们分别构成了S M_0 和 Z Y H_0（图.2a）。从这两个品种中总共获得了39,802个DEG。其中，在“Jinba”的五个时间序列阶段中交集到了2084个DEG，在“zaoyihong”中交集到了3144个DEG。我们还确定了在每个时间序列阶段唯一表达的DEG，如（图2b）所示，结果表明每个阶段都有其自己的独立防御机制。

研究结果表明，抗病品种“Jinba”中有多达33,343的DEG和易感品种“zaoyihong”中26,173的DEG对交链孢霉感染有反应。这要大得多基因数量比以前在类似转录组研究中报道的数量要多。通过使用BINGO，进行了GO分析，以进一步表征鉴定出的DEG。如图2c所示，DEG分布在三个GO类别中：“生物过程”，“分子功能”和“细胞成分”。富含“细胞成分”类别的DEG主要涉及“细胞壁”，“过氧化物酶体”，“核质”和“类囊体”。 “生物过程”类别中的丰富术语主要包括“对压力的反应”，“对内源性刺激的反应”和“碳水化合物代谢过程”。 GO术语“水解酶活性”，“激酶活性”，“DNA结合转录因子活性”，“碳水化合物结合”和“脂质结合”丰富在“分子功能”类别中。

图2. 交链孢霉侵染后“Jinba”和“zaoyihong”中DEG的统计和GO分析。对交链孢霉感染的上调和下调的差异表达基因（DEG）的统计分析。 b在“ Zaoyihong”（上）和“ Jinba”（下）中，针对交链孢菌感染的差异表达基因（DEG）上调和下调的维恩图。 c GO分析“Jinba”和“zaoyihong”中对交链杆菌感染的DEG反应。

链霉菌侵染过程中基因共表达模块的鉴定

14个模块的特征基因与不同的感染阶段相关（图3）。通过模块-性状关系和模块-样本关系分析研究了金线莲和枣红之间共表达模块在交链孢霉感染不同阶段的保存。在大多数模块中，两个品种在不同接种时间下的基因趋势几乎相同，如图中的“黄色”、“棕褐色”和“棕色”所示。有趣的是，一些模块对交链孢霉的感染有所不同。值得注意的是，作者确定了“Jinba”的一个模块，即与图中“绿松石”颜色相关的模块，该模块是特定于品种的。

图3 WGCNA分析“ Jinba”和“ Zaoyihong”转录本。基于“ Jinba”和“ Zaoyihong”中共表达网络分析的基因网络图。

鉴定与坏死病变有关的转录调控模块

结合WGCNA结果，确定了处于不同感染阶段的关键基因，如图4所示。“黄色”模块中的基因表达在1 hpi时被上调最多，与感染的早期阶段相对应。菊花叶片对交链孢霉感染的反应。在6-1 2 h pi时，基因表达在6 hpi或12 hpi时出现峰值上调。许多在24 hpi或36 hpi处具有转录峰的基因被分类为“黑色”或“棕色”模块。在晚期的24 hpi或36 hpi，病灶扩展到接种部位之外。在“黄色模块”中，确定了与防御相关的三个关键基因，例如EDS1同源物（CmEDS1; DN78955c0_g1），MLO1同源物（CmMLO1; DN86381c0_g1）和NPR4同源物（CmNPR4; DN80377c1_g1）。由于转录因子在基因调控和植物免疫中起着重要作用，因此、进一步研究了它们的调控网络。鉴定出的WRKY4同源物显示了与三个关键防御反应基因的调节关系。此外，在“黄色”模块中RPS4同源物和PYL4同源物的表达上调（图4a）。在此之前，已确定了两个与植物病原体相互作用相关的中枢基因：WRKY33同源物（CmWRKY33; DN63096c1_g1）和CML45同源物（CmCML45; DN69937c2_g1）。发现其产物在ET信号转导途径中起重要作用的ERF2同源物（CmERF2; DN90778 c3_g1）与两个关键基因（CmWRKY33和CmCML45）有很强的调节关系（图4b）。在菊花对链球菌感染的反应后期，鉴定了两个属于MATE家族的中枢基因，它们参与了多种药物和有毒化合物的挤出过程。DTX30同源物（CmDTX30; DN96458c3_g7）;和DTX32同源物（CmDTX32; DN73836c0_g2）。一个TF，WRKY6同源物（CmWRKY6; DN87555c0_g2），也被确定为关键基因。此外，HSF24同源物（DN8266 2c0_g1）和NAC029同源物（DN73063c1_g1）与棕色模块中的其他基因有很强的调控关系，而后者与两个关键基因（CmDTX30和CmDTX32）也有调控关系（图4c）。

图4.菊花叶对交替链球菌感染的不同阶段的DEG。黄色模块的共表达网络。b tan模块的共表达网络。c棕色模块的共表达网络。

共表达网络表明，高抗性品种“Jinba”对交链孢霉感染有独特的反应

菊花“Jinba”品种比“zaoyihong”在交链孢霉感染期间具有更高的抗性和更小的坏死病灶（图5a）。“绿松石”模块（r = 0.83，p = 9e-04）（包括8228个基因）具有特定的品种，在交链孢霉感染后被上调（图5b），可能与抗性表型有关。检查了该模块的基因以进行进一步分析。基于DEG分析，发现10个属于不同转录因子家族的关键基因，例如AP2-EREBP，AUX，bHLH，MADS，MYB，NAC，PLATZ和TRAF，被差异表达（图5d）。根据WGCNA，共有52个与转录因子相互作用的基因参与了植物-病原体的相互作用，包括DN80856c2_g1。有趣的是，属于AP2-EREBP TF家族的DN80856c2_g1（称为PTI6）在植物与病原体的相互作用中也起着重要作用。结果表明，关键转录因子可能与参与植物-病原体相互作用过程的基因相互作用。此外，在与关键转录因子相互作用的基因中，有43个参与激素信号转导途径，这可能对交链曲霉挑战的抗性品种至关重要。调节关系通过Cystoscope软件可视化，如图5c所示。对与TF相互作用的DEG的分析显示了一个ABCA3家族基因（DN91413c1_g3）和四个MATE家族基因（DN94014c1_g1; DN90910c1_g1; DN95310c2_g2和DN82887c0_g1）在抗性品种'Jinba'和表Sd中明显表达（图5）。

图5.抗性品种“Jinba”中高表达基因的分析。接种后12小时，“Jinba”和“zaoyihong”的菊花表型出现了变化。 b共表达的基因显示在绿松石模块的热图和条形图中。热图中的红色矩形代表高表达；绿色矩形代表低表情。 c绿松石模块由Cytoscape可视化。 d热图显示了参与PPI和HST的DEG的表达谱以及绿松石模块中的转录因子。颜色表示模块中基因的表达水平，如图例所示。

CmWRKY33.1的过表达导致对黑斑病的敏感性增加

在研究中，发现WRKY家族基因在病变扩散时被高度表达。根据转录组数据中的WRKY33同源序列，克隆了一个WRKY33同源基因：CmWRKY33.1。为了进一步验证CmWRKY33.1的功能，构建了一个pMDC43-CmWRKY33.1表达载体，用于菊花的遗传转化和获得的过表达的转化品系。电泳检测法表明该载体已成功转化为野生型“Jinba”（图6a），根据qPCR分析，CmWRKY33.1在转化株中的表达显着增加（图6b）。此外，接种试验表明，与野生型“Jinba”相比，过量表达CmWRKY33.1的三个转化株对黑斑病的敏感性更高（图6c）。

图6.接种交链孢霉后CmWRKY33.1转基因系和表型的检测。

Model图

最后作者绘制了一个模型，以阐明菊花叶在不同阶段对交链曲霉感染的反应，并将抗性品种“Jinba”与易感品种“zaoyihong”的模型进行了比较（图7）。在早期阶段，钙信号转导途径被激活以响应感染。随着钙信号的传递，更多的植物免疫反应被激活，尤其是涉及ET信号转导途径的植物。因为交链孢霉可以产生大量毒素，所以推测菊花叶可能抵抗通过MDR蛋白解毒产生的损害。此外，鉴定了一系列关键基因，包括PTI6和PR3基因，这些基因在抗性品种“Jinba”中对交链孢霉的感染特别有效地表达。

图7是菊花叶对交链孢霉感染的应答的基因表达模型。

评论

在转录组测序的基础上，结合权重基因共表达网络分析WGCNA、荧光定量PCR和菊花遗传转化实验，绘制了菊花响应黑斑病菌侵染的免疫时序图。研究发现，在病菌侵染早期，钙信号、EDS1介导的免疫反应被激活；随着病斑的形成，更多的植物免疫反应发挥作用，尤其是乙烯信号介导的免疫反应；在侵染后期，鉴定了一系列菊花免疫反应的核心基因，包括多药抗性蛋白，丰富了菊花抗病分子机理。另外，通过比较抗病和感病菊花品种响应黑斑病菌侵染的差异，鉴定了一系列在抗病品种中高表达的基因，为进一步了解菊花的抗性机理，科学防治菊花黑斑病提供了理论指导。

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