编译：姜意达，编辑：十九、江舜尧。
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导读
星形胶质细胞（Astrocytes）在整个中枢神经系统中的主要细胞类型，在调节突触（synapse）传播,调节血流与大脑的代谢功能中有重要作用。但是，许多特定的转化器和星形胶质细胞在颈椎和小脑都具有相应的编码功能。本实验采用单细胞测序技术探究整个前脑区域星形胶质细胞的分子多样性。我们从数据中确定了成年小鼠和海马脑皮层的五个不同转录组中的细胞亚型并揭示了各个亚型的独特空间定位，从形态与生理两个层面确定了星形胶质细胞分布。
原名：Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution
译名：以单细胞分辨鉴定区域特异性星型胶质细胞亚型
期刊：Nature Communications
IF: 11.88
发表时间：2020.03.5
通讯作者：Matthew G. Holt
通讯作者单位:比利时鲁文维勃-库鲁纹脑疾病研究中心Glia生物学实验室
DOI号：https://doi.org/10.1038/s41467-019-14198-8
图1：单细胞测序步骤与细胞类型分析 （A）通过运用机械研磨技术从C57BL/6J 小鼠全脑中分别制备皮质（Cortical CX）和海马（hippocampal HP）独立的两种星形胶质细胞，并分开制备两组动物的皮质细胞悬浮液。用ASCA-2-PE 特异性抗体在悬浮液中，标记星形胶质细胞，使用FACS收集单细胞并使用改良好的Smart-Seq2 进行单细胞文库制备。最后构建了2976个文库，使用NextSeq 500 系统 (Illumina)进行测序。（B）测序时，每个文库平均读取1M，总共保留了2015个高质量文库进行进一步分析。在这些文库中，大部分读段为外显子（编码序列CDS；UTR，非编译区），而一小部分读段则位于内含子和基因间区域。(C)在Seurat中通过tSNE图可视化识别出主要的细胞类型为高阶细胞（higher-order cells），在tSNE图中，每个点代表一个单元格。具有相似分子特征的细胞会聚在一起；细胞类型根据特定标记基因的表达进行分配（不同的颜色标记）。（D）根据图1C中Seurat分类对高阶细胞类型中的基因表达进行热图分析。灰色：无表达；黄色，表达低；红色：高表达。
1 单细胞mRNA测序揭示星形胶质细胞异质性
通过从C57BL/6J 小鼠中制备了皮质（CX）和海马（ HP）两种星形胶质细胞后，将细胞悬浮液中用ACSA-2抗体（与荧光团藻红蛋白PE欧联）标记。通过荧光激活细胞分选术（FACS）分离活的星形胶质细胞，总共对2976个单独的文库进行了Smar-seq2测序（图1B）。通过FastQC筛选出2015个高质量单细胞库，大部分结果位于外显子区域（83%），覆盖2148个基因，只有11%位于内含子区域（图1B）。通过Seurat中的聚类分析，运用已知标记基因的表达谱成功分选出五种不同的细胞亚群（AST1-5）(图1C)（图2A,B）。从tSNE图中可得出，AST4与AST5形成不同的细胞簇并含有不同的基因表达水平，而AST 1-3合为一簇说明了这些细胞亚型之间具有相同的基因表达水平。与此同时，发现小鼠皮层和海马体细胞类型有很大的区别，其中AST1和AST4主要是海马体，AST2主要是小鼠皮层，AST3和AST5在大脑区域之间均匀分布（图2C）。此次实验方案可以用于识别成年小鼠大脑中的星形胶质细胞的区域异质性。
图2 ：成年小鼠皮质与海马中星形胶质细胞亚型的鉴定。（A）通过单细胞测序技术，鉴定不同的星形胶质细胞亚型（AST）。从高阶聚类中总共确定了1811个星形胶质细胞，最终，五种星形胶质细胞亚型通过使用Seurat提取出来。在tSNE图中，每个AST用不同颜色区分开来。 （B）为过表达基因的分层聚类基因表达热图。行为细胞，列为基因。红色：基因表达低； 黄色，高表达。数据为：按比例缩放的ln标准化后的结果。（C）源自皮质（CX）或海马（HP）的星形胶质细胞中的基因表达。（D）细胞亚型特异性标记基因的表达。
2 星形胶质细胞亚型中特有的分子特征
在图2与3中，作者发现了星形胶质细胞共有许多基因（表达高于60%以上的），并通过特定基因的富集鉴定出星形胶质细胞的亚型（图2D, 3A）。为了深入了解差异表达基因的作用，对转录因子进行基因功能注释（DAVID）并结合UniPort数据库进行手动注释。结果显示，首先，在星形胶质细胞上高表达的转录因子，含有Dbx2 和Sox9分别作用于神经网路中，还有参与糖代谢能量转换的转录因子（Eno1，Sdha，Sdhb）。与此同时，胆固醇的合成和运输（Apoe），谷氨酸的摄取（Slc1a3）和谷氨酸的代谢（Glud1）也都是合成星形胶质细胞的常见分子机制（图3B）。在具有差异性表达的基因中，转录因子（Id3，Etv5，Wfs1）与维持细胞特有的转录网络相一致。另外，主要的星形胶质细胞的功能包括突触传播（Chrdl1，Lrtm2，Sema4b）；吞噬作用（去除突触，Mertk）; 突触功能(Agt，Ndrg4，Ppp1ca，Dbi，Slc7a10, Glul); 神经传递(Gria1与Gabrg1);离子运输（Kcnj16，Kcnj10，Kcnk1），血脑屏障的形成和维持（Mfsd2a）以及免疫功能（Tril和Tlr3）（图3C）。此外，根据基因表达水平找出一组星形胶质细胞所特有的未被发表的标记物。这些基因主要来自于细胞架构功能（Gfap）; 膜融合（Unc13c）; Wnt信号通路（Frzb） ;细胞命运特异性（Ascl1）以及翻译后蛋白质修饰（Ogt）。因此，本实验数据进一步证实了星形胶质细胞的分子异质性，这种异质性包括公认的星形细胞功能异质，并且存在于大脑区域内。
图3：星形胶质细胞中的差异表达分析。（A）星形胶质细胞中基因表达数量（普通类型）以及每种亚型中特异性富集的基因数量。（B）按照生物学功能划分的星形胶质细胞亚型及其转录因子。（C）星形胶质细胞亚型所特有的基因类型。
3 与神经生长发育有关的特有亚型：AST4
通过分析AST4的基因中得知，有相当一部分基因参与有丝分裂和细胞周期控制（Cdk4和Sirt2），神经转录调控（Ascl1和Emx1），神经发生和神经元分化（Dab1）。已知Ascl1在神经干细胞和扩增祖细胞中表达，我们假设AST4代表海马神经干细胞或祖细胞。在成年小鼠大脑的切片中，用Frzb和Ascl1探针作为此类细胞亚型的特异性标记，而Slc1a3探针作为干细胞和星形胶质细胞的一般标记。为了详细描述星形胶质细胞的定位和定量，我们对图像进行了手动分割，证实了与单个细胞核的共定位（图4A）。AST4在整个大脑中的分布以两种不同的方式进行定量。首先，根据在给定区域中检测到的AST4星形胶质细胞的数量，绘制出整个大脑的分布图（中间图，图4A）。其次，确定每个大脑区域中AST4星形胶质细胞相对于所有星形胶质细胞总数的比例（右图，图4A）。AST4主要位于海马的亚颗粒区（subgranular zone），形成大量的Slc1a3+细胞。该结果证实了可以通过单细胞测序的方法识别出单个星形胶质细胞亚型，并可以运用ISH进行定位功能。
图4：成年小鼠大脑中AST4和AST5。通过荧光原位杂交技术，确定AST4和AST5的位置。（A）通过高表达水平的Frzb，Ascl1和Slc1a3鉴定AST4。（B）通过低表达Ogt，高表达Fam107a和Slc1a3来确定AST5。分别获取3只动物的动物切片，并制图：左上方：冠状切片的低倍放大图像。黑点表示星形胶质细胞亚型早大脑半球的分布。右：条形图（从左至右显示）为每个细胞中RNA标记的荧光计数（在所有分析区域中显示所有细胞的荧光计数）。重要的亚型的星形胶质细胞用阴影框突出表示（根据图2A中使用的方案进行颜色编码）。误差线在图中为SEM，“ +”基因表达高，“-”基因表达低或无表达。
4 中间祖细胞：AST5
AST5是通过Smart-seq2测序发现的最稀有的亚型（图2A），AST5与AST4有相当大的重叠，并与有丝分裂和细胞周期控制有关的基因（Sirt2，Sept2，Emp2等）。但是，这两个细胞群也存在差异：AST5含有经典星形胶质细胞基因，例如在糖代谢和能量代谢起到关键作用的基因，AST5为祖细胞和成熟星形胶质细胞之间的过渡状态。AST5细胞中，Fam107a基因处于较高表达而Ogt基因属于低表达状态，为此AST5的分布难以确定，有可能是因为样品之间群在较大差异(图4B)。通过Slc1a3+细胞划分，AST5在海马乳头层中为主要细胞类型。
5 成熟星形胶质细胞：ASTS1,2,和3。
AST1,T2与T3的基因富集与成熟星形胶质细胞功能较为吻合。在AST1中，Gfap与Agt都为高表达。通过ISH分析平台，AST2和AST3在整个皮质层和海马中均显示出高度的特异性。AST2均匀分布在整个皮质层上，AST3分布在整个皮质和海马体中但总体表达水平略低。主要细胞亚型AST1定位于海马的脑膜层和腔层分子中。（图6A）. AST2 在脑膜区域中含量较低，这是因为AST2中的Gfap表达也很低(图2)，根据重要基于的差异性表达，我们认为这些亚型可能对功能进行不同的调节。如图七所示，为了便于解释，我们也总结了子类型之间的复杂空间关系。
图6：成年小鼠大脑中AST3。AST3是使用拆分标记方法进行映射的，分别对切片的（A) Af和Slc1a3的低表达可用以区分AST3与AST1 （B）Agt和Slc1a3的低表达用以区分AST3和AST2。
图7：成年小鼠脑中星形胶质细胞亚型位置的示意图 指示的位置基于原位杂交数据（图4-6）并标记在成年小鼠大脑的切面上，颜色编码（如图2A所示），比例尺，500μm。
6 星形胶质细胞亚型之间的形态相关性
星形胶质细胞亚型的不同转录组谱和空间位置可预测其形态和功能。通过采集大量星形胶质细胞，探究不同亚型之间的形态或功能特征。因为AST1,2和3的区域最具有代表性，我们决定样本研究范围只包含AST 1、2和3区域。图4 A与B所示，6.8％的细胞共表达五个或六个神经肽。由此可得，单个神经元中可出现多个共表达神经肽，这些结果与以前的报道一致：即神经元除了有特定的神经肽之外也可以表达其他神经肽。为了进一步研究单个神经元中神经肽的共表达，比较了单个神经元中不同神经肽的表达水平（图5）, 在单个神经元的水平上, 少数神经元以相似的水平表达存在于两个或三个神经肽中。在这里我们提出一个问题，是否可以根据生理状态的差异而改变神经元中不同信号分子的表达水平。根据高尔基染色和星形胶质细胞标记物S100β36的结果中得知，位于皮质2–4层（包含AST2和AST3）的星形胶质细胞比海马CA3区（包含AST3）的星形胶质细胞更小。使用基因编码的标记蛋白标记的皮质星形胶质细胞，我们确定了四种显着的形态亚型（AD），它们以不同的比例分布在各个皮质层中（图4-6）。边缘星形胶质细胞（AST1）与簇D有很大的相似性，因为它们独特的形态和定位在皮层，簇B存在于皮质层1–6中，而簇C存在于皮质层2–5中，在层1和6中的比例较低。这些分布分别显示出与AST3和AST2相似。但是，簇A仅限于第5层和第6层，这表明转录组和形态之间的对应关系不完整。
图5：成年小鼠大脑中AST1和AST2的差异模式。（A）Af和Slc1a3的低表达可用以区分AST3与AST1 （B）Agt和Slc1a3的低表达用以区分AST3和AST2。
7 星形胶质细胞亚型的生理相关性
星形胶质细胞的激活通常与细胞内Ca2+的瞬时升高有关，而Ca2+的升高与细胞功能有关。作者研究了使用急性冠状组织切片差异化星形胶质细胞Ca2+信号的可能性，其中细胞用Ca2+指示剂Fluo-4标记，并与SR101共同标记分选出星形胶质细胞，并使用双光子显微镜在皮质层1，皮质层3-5和海马CA1中获取图像。当神经元激活时，基线（BASE）反映星形胶质细胞的活动。然后，我们使用河豚毒素（TTX）阻断神经元活性，从局部神经元网络活性中分离星形胶质细胞。最后，将苯肾上腺素（PHE）应用于经TTX处理的切片，直接激活星形胶质细胞中强烈的Ca2 +的水平（图8A）。尽管作者观察到基线和TTX条件下跨区域的星形胶质细胞活性存在显着差异，但在使用PHE后的差异最为最明显（图8C）。星形胶质细胞进行了分层聚类（图8D，E）。作者确定了三个不同的星形胶质细胞簇，它们分别通过皮层1和3–5以及海马CA1分布。群集2主要包含来自第1层和第3-5层的皮质星形胶质细胞。当与ISH数据的比较，得知聚类2可能包含AST1和AST2，位于皮质中。簇3包含来自大脑各个区域的大致相等数量的星形胶质细胞，与具有AST3同一性的细胞一致。（图8F）。综上所述，这些数据表明分子定义的星形胶质细胞亚型与具有不同形态和生理反应的细胞共享重叠的空间位置。
图8：星形胶质细胞亚群独有的Ca2+瞬时特性。（A）星形胶质细胞（箭头）钙水平的瞬变。比例尺50μm。（B） 活性星形胶质细胞即对PHE有反应的活性细胞。在BASE和TTX条件下，Ca2+瞬变为蓝色。（C）瞬态参数按照大脑区域进行分组，数值是每种条件的平均值。（D）Ca2 +瞬态参数的层次聚类 （E）在D中定义的每个簇来自大脑区域的星形细胞的比例。（F）星形胶质细胞峰参数按簇进行分组。
星形胶质细胞在中枢神经系统中已知具有许多不同的作用，例如突触的形成与突触传递。但星形胶质细胞是否有特有的某些功能尚未明确，尽管有证据显示在小鼠视觉皮层与海马体等区域形成局部特有的微神经元回路。为了探究大脑区域之间的多样性，本课题通过单细胞测序方法，以获取星形细胞异质性并且不受中枢神经系统发育中的转录机制所干扰，作者得以在转录水平上区分了多种星形胶质细胞亚型。然而，尽管星形胶质细胞亚型之间有许多共同基因，但亚型之间的转录水平差异较大，这说明星形胶质细胞的功能具有独特性，本研究的ISH结果证明了这一点。通过海马和皮质的差异性确定星形胶质细胞为局部多样性。根据转录组数据表明，皮质和海马星形胶质细胞种群之间有密切的联系。例如，AST1和AST3在整个皮质和海马区中的广泛分布可能为胚胎皮层的共同发育的源头。此外，AST5具有独特的转录组，似乎位于祖细胞（AST4）和成熟星形胶质细胞（AST1）之间。尽管存在多种可能性，但目前尚不清楚AST2和AST3之间的关系。这些亚型可以由一类常见的祖细胞或由早期细胞而形成，并由邻近CNS细胞而协助运行，或者，它们可以由不同类别的祖先形成，它们在cortex51中相互混合。但是，在第二种情况下，通常与发育相关的信号（例如Shh信号）有关，作用于激活并维持星形胶质细胞的多样性。实际上，在整个皮质中发现的AST2和AST3具有差异表达的基因都与神经传递有关。AST2富含与谷氨酸能神经传递有关（包括Slc7a10，与有效的NMDA激动剂D-丝氨酸的动员有关）。相反，AST3与GABA能神经传递相关。这表明，星形胶质细胞和神经元之间的相互作用可能会促进循环功能的多样性。本研究阐明了星形胶质细胞转录组多样性的，并证明了形胶质细胞与Ca2+信号传导的相互联系。但是，仍有一些问题需要解决。例如，第6皮层中的一部分星形胶质细胞与AST3相关，似乎具有不同的形态。这种独特的基础机制，需要进一步研究。总而言之，作者已经证明了星形胶质细胞的区域内的异质性，并且证明这些特性存在于皮质分层和海马体中。此外，本研究提供证据表明这些亚型具有不同的形态和生理学。这项工作为研究星形胶质细胞异质性提供了解决路线和可靠蓝图。此数据可为最终阐明中枢神经系统形式和功能作为可靠依据。研究者始终对于神经系统中的重要细胞：星形胶质细胞及其特有的功能通路这一方面了解甚少，但随着生命科学的发展，神经系统已经成为关注的热点，迫切需要揭开其中的奥秘。本文运用了单细胞转录组测序技术探究整个前脑区域星形胶质细胞的分子多样性，并成功区分出脑皮层的五个不同转录组中的细胞亚型。此研究揭示了各个亚型的独特空间定位，为健康与患病状态下的大脑活动的状态提供了宝贵基础技术指导。
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