科研｜国人作品：心房颤动的心外膜脂肪组织中功能性长链非编码RNA的全基因组筛选
编译：KT!，编辑：十九、江舜尧。
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房颤是一种最常见的心律失常，房颤患者心衰和缺血性中风的风险显著增加。但是目前关于房颤的病理机制，尤其是与长链非编码RNA相关的机制还未完全明了。在这篇研究中，研究者收集了6个房颤和6个窦性心律患者的心外膜脂肪组织中RNA的序列数据，鉴定了其中差异表达的蛋白编码基因和长链非编码RNA。从功能学上发现，差异表达的蛋白编码基因显著富集在骨骼发育型疾病、慢性肾脏衰竭和肾脏疾病中。特别的是，同位序列基因，尤其是反义RNA，HOTAIRMI,HOXA-AS2和HOXB-AS2在房颤的心外膜脂肪组织中显著下调。对于失调的长链非编码RNA的生物功能学预测发现TNF信号通路是最常见的通路，而IncRNA可能参与其中。长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因16（small nucleolar RNA host gene 16 SNHG16）和RP11-471B22.2可能通过与通路中的蛋白质相互作用而分别参与TGF-β信号或者与ECM-受体交互作用。总的来说，研究提供了一些房颤中潜在的致病性IncRNA,这可能为相关研究人员研究其功能以及开发新的治疗有所帮助。
论文ID
原名：Genome-wide screening of functional long noncoding RNAs in the epicardial adipose tissues of atrial fibrillation
译名：心房颤动的心外膜脂肪组织中功能性长链非编码RNA的全基因组筛查
期刊：Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease
IF: 4.328(2018年)
发表时间：2020.02.26接收
通讯作者：Yangyang Zhang＆Ruilin Zhang＆Changfa Guo
通讯作者单位：同济大学医学部＆武汉大学基础医学院＆复旦大学
DOI号：10.1016/j.bbadis.2020.165757
背景介绍
心房颤动（房颤）是一种最常见的心律失常，房颤患者心衰和缺血性中风的风险显著增加。在美国，大约有50万人前往急诊科就诊的原因就是房颤，而且随着年龄的增长房颤发生风险也逐渐增加。心房重构是房颤病因学探索中一个重要的基础性的改变，心房纤维化和传导异常在房颤病人中也可以观察到。
近期越来越多的证据表明，心外膜脂肪组织功能紊乱在房颤的病因学中可能具有重要作用。心外膜脂肪组织（EAT）是一种脂肪库，位于心肌层和心外膜之间。EAT具有分泌促炎分子的能力，其代谢表现受到致病条件的影响。有研究显示心外膜脂肪组织分泌的脂肪-纤维因子，比如激活素A和MMP8，可以促进心脏纤维化，这进一步导致了房颤的发生。同时，另一个研究通过对缺血性心脏病突发猝死和非缺血性心脏病突发猝死的患者心外膜脂肪组织的miRNA表达谱的分析发现，miRNA表达谱在缺血性心脏病突发猝死患者中下调。尽管目前有许多研究揭示了长链非编码RNA的表达模式在房颤的发病机制中的作用，但是对于人类心外膜脂肪组织中的长链非编码RNA表达模式的研究较少。
长链非编码RNA在转录水平或者转录后水平发挥作用，是染色质重构、基因剪接调控和mRNA降解的调控子，和许多病理过程相关。因此，理解这些重要的遗传因子的机制可能帮助我们建立房颤病因学更好的蓝图。在这篇研究中，研究者通过对6个房颤和6个窦性心律患者的心外膜脂肪组织中的RNA序列数据分析，从而鉴定与房颤病因学相关的长链非编码RNA，然后采用整合的方法预测这些失调的长链非编码RNA的功能学，并期待能够揭露由这些长链非编码RNA介导的一些房颤病因学中的潜在机制。
研究设计
1.数据收集
研究根据检索号（accession number）SRP217534从NCBI的SRA数据库中下载RNA序列数据；从心脏的房室沟处获取心外膜活检样本。
2.基因表达分析
将下载的原始数据首先转换为fastq格式，然后通过基因序列比对软件hisat2与UCSC的hg19版本校对。基于FPKM的基因表达水平通过stringtie和R包软件定量分析。根据GENCODE v19的注解，非编码RNA的生物型中3prime_overlapping_ncrna, antisense, lincRNA, processed_transcript, sense_intronic, 和sense_overlapping被视作长链非编码RNA。差异性表达分析采用t-检验和差异倍数的方法，P值以0.05为显著性的判断界限，差异倍数以2为界限值。
3.功能富集分析
功能富集分析包括基因富集的KEGG通路、GO富集，疾病富集采用超几何分布检验，也称为普通富集分析（ORA）。
4.房颤中失调的IncRNA的功能推测
对于这些IncRNA的功能学进行关联性分析和基因集富集分析（GSEA）。首先对IncRNA和蛋白编码基因（PCGs）进行关联性分析，接下来，GSEA对已知IncRNA通路中高度相关的基因进行富集丰度值的检测。
5.IncRNA和蛋白关联性预测
采用深度学习法对LncRNA和相关蛋白质进行预测（LncADeep），它们在上下游基因排列上的共现性也都考虑在内，最后与蛋白质相关联的LncRNA基因也参与差异表达基因(DEGs)富集的通路中。
6.数据分析
两样本比较采用t检验或者秩和检验。层次聚类分析和主成分分析由R v3.6.0.完成。P<0.05视为具有显著性差异。
结果
1.利用长链非编码RNA（LncRNA）和蛋白编码基因（PCGs）之间的不同表现以区分房颤（AF）和窦性心律（SR）
利用RNA序列数据量化6个房颤和6个窦性心律研究对象的心外膜脂肪组织的表达情况，以此来描述房颤中的转录组变化特征。在这些样本中总共鉴定了12656个PCGs和2213个LncRNA，鉴定结果以至少3个样本中超过1个FPKM为界限。通过主成分分析发现PCGs和LncRNA都可以区分房颤和窦性心律(Figure 1A-B)。LncRNA的误诊例数只有1例，即错误地将房颤样本误认为窦性心律样本。而PCGs的误诊例数为 2例，因此前者的鉴别方式优于后者。此外，对这些样本进行的差异表达基因的分析，共鉴定出376个失调的PCGs和95个LncRNA,仍然发现这两者都可以将AF和SR样本准确区分(Figure 1C-D)。这些结果表明，LncRNA可能在AF病理机制中存在一定作用，同时也说明，PCGs在区分AF和SR中的不同性表现。
2.差异表达基因（DEGs）的功能富集分析
为了在转录组水平揭示房颤的功能学改变，研究者进行了差异表达基因的KEGG通路集、GO集和疾病分类数据集的分析。结果发现，某些KEGG通路比如TGF-β信号通路、ECM受体交互作用、PI3K-Akt信号通路以及类固醇生物合成这些通路在上调的基因中高度富集。而在下调的基因中主要富集了hippo信号通路，金黄色葡萄球菌感染和补体级联途径（Figure 2A）。TGF-β信号通路和ECM受体交互作用可能和心外膜脂肪组织的炎症因子分泌有关。GO富集性分析发现骨骼肌系统和肾脏发育相关事件在差异表达的基因中显著富集（Figure 2B），说明这些发育型疾病的基因与房颤发病机制可能紧密相关。疾病分类分析（DO）也同样发现骨骼发育性疾病、慢性肾脏衰竭和肾脏疾病在差异表达的基因中显著富集（Figure 2C）。此外，心血管疾病比如房间隔缺如、肺动脉高压和家族性高脂血症也在差异表达基因中显著富集。特别的是， TLL1, GATA4, TBX20, INHBA, GREM1, NOX4, BMP7, LYVE1, JUN, CP, FOXC2, CETP, RXRG, CRABP2, IRS1 这些基因也包含在这些疾病中，是致病性基因，提示这些基因可能也参与房颤。
3.同位序列(HOX,同源异型盒)基因在房颤的心外膜组织中下调
研究者将差异表达基因映射到人类基因组中，绘制了染色体7，10，11，17的基因热图(Figure 3A)。HOTAIRM1、HOXA4、HOXA2、HOXA3、HOXA-AS2、
HOXA6、HOXA7、HOXB7、HOXA5、HOXC6、HOXD4、HOXB6、HOXB4、HOXB-AS2、HOXB5和HOXC4这些同位序列在房颤的心外膜脂肪组织中显著下调（(Figure 3B）。其中，HOTAIRM1, HOXA-AS2 and HOXB-AS2这三个序列是同位序列基因簇中的反义RNA，它不编码蛋白质。HOTAIRMI和HOXA-AS2位于HOXA基因簇上，而HOXB-AS2位于HOXB上面（Figure 3C）。众所周知，HOX基因簇上的反义RNA可以调节正义蛋白编码基因的表达，说明这些同位序列基因的下调可能与其中的同位序列反义RNA有关。除此之外，据报道，同位序列基因可以促进心脏发育，说明这些基因的失活可能与房颤所致心脏损伤有关。
4. 差异表达的LncRNA在炎症相关信号通路中最常见
就房颤心外膜脂肪组织中失调的LncRNA的功能在房颤发病机制中的作用目前仍然未知。因此研究者首先进行了失调的LncRNA和PCGs之间关联性的分析。接下来，进行基因集富集分析来识别这些非编码RNA的通路。值得注意的是，LncRNA共参与15种信号通路，而这些通路大多数是与炎症相关的通路。其中TNF和NOD样受体信号通路在房颤心外膜脂肪组织中是最常见的通路（Fig.4A,FDR<0.05）。研究者发现LINC00694、RP11−243J16.7、RP11−535C21.3、RP11−20B24.7、RP11−603J24.17、RP11−1057B6.1、RP1−267L14.3、和RP11−888D10.4这些差异表达的LncRNA与TNF信号通路紧密相关（Fig.4B, FDR < 0.05）。这些结果表明，LncRNA可能通过调控炎症通路的活动而参与房颤的发病机制。
5. 功能性LncRNA参与与蛋白质相关联的通路
为了进一步探索失调的LncRNA的功能，研究者通过整合方式预测了LncRNA-PCGs关联体。首先，LncRNA和PCGs编码的蛋白质之间的关联由深度研究方法来预测,在上调和下调基因列表上共现性的基因也被考虑在内。在上调的LncRNA中，发现SNHG16和RP11-471B22.2与22种PCGs相关(Fig.5A)。而且，任何已知的LncRNA和某些通路之间的联系是由相关联的PCGs来连接的。值得注意的是，BAMBI和INHBA参与TGFβ信号通路，而SNHG16和BAMBI和INHBA高度相关 (Fig. 5B）。此外，预测发现RP11-471B22.2可以通过与胶原蛋白如COL4A3和COL4A4关联来调控ECM-受体交互作用。总的来说，这些结果表明SNHG16和RP-471B22.2可能通过与某些蛋白质关联而分别参与调控TGF-β和ECM-受体交互作用。
讨论
研究也发现，同位序列基因（HOX）在房颤中显著下调，这些下调的同位序列可能与那些同位序列中的反义RNA相关。值得注意的是，同位序列HOXA5在小鼠中通过抑制TNC/TLR4/NF-κB炎症信号促进白色脂肪组织棕色化。此外，据报道，同位序列可以促进心脏发育。因此，研究者推测同位序列的失调可能导致心脏祖细胞的失活，从而导致了房颤的发生。对这些失调的LncRNA进行生物功能学预测发现，LINC00694、RP11−243J16.7、RP11−535C21.3、RP11−20B24.7、RP11−603J24.17、RP11−1057B6.1、RP1−267L14.3、和RP11−888D10.4与TNF信号通路紧密相关，此外，SNHG16和 RP11-471B22.2可能通过与通路中的蛋白质关联而分别参与TGF-β信号通路和ECM受体交互作用。因此研究者推测SNHG16和RP11-471B22.2这两种LncRNA可能与一些蛋白质相关联，这些蛋白质包括BAMBI, INHBA, COL4A3, and COL4A4，这种关联具有增强或者减弱某些蛋白和通路的活动的作用。TNF和TGF-β信号与炎症相关通路有关，比如氧化应激、凋亡、纤维化的病理过程，而这些都可以促进房颤基质的形成。
此外，本研究也存在一些缺陷，如缺少对功能性LncRNA的实验验证、样本量小以及缺少对LncRNA潜在机制的进一步探索。但是，本研究提供了房颤中潜在的一些致病性LncRNA,这些发现为同领域的研究者进行更深层次的功能学研究和在房颤管理中开发新的治疗方法提供了帮助。
研究亮点：
1. 通过对心外膜脂肪组织中的RNA序列数据分析从而揭示了房颤中差异表达的蛋白编码基因和长链非编码RNA。
2. 同位序列基因(HOX genes)在房颤中显著下调。
3. 失调的长链非编码RNA揭示了TNF信号通路在房颤中是最重要的。
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