科研 | Bioinformatics：基于多组学研究奶牛产奶量和质量相关的功能基因和代谢调控机制（国人作品）
编译：贤，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Multi-omics reveals functional genomic and metabolicmechanisms of milk production and quality in dairy cows
译名：基于多组学研究奶牛产奶量和质量相关的功能基因和代谢调控机制
期刊：Bioinformatics
IF：4.531
发表时间：2019.12
通讯作者：刘建新、管乐珞
通讯作者单位：浙江大学&加拿大阿尔伯塔大学
DOI号：10.1093/bioinformatics/btz951
实验设计
16头中国荷斯坦奶牛根据产奶量随机分为苜蓿干草饮食组（AH）和玉米秸秆饮食组（CS），饲养65天后测量血液参数，瘤胃氨氮和挥发性脂肪酸含量及从每组中随机选取6头奶牛屠宰，获取肝脏和乳腺组织用于代谢物分析和基因组分析。
结果
1. AH和CS之间奶牛的血液和瘤胃发酵参数变化
当以低质量玉米秸秆饲养奶牛时，与高品质牧草苜蓿相比，牛奶产量显著下降，因此饲料转化率显著较低，乳蛋白，乳糖含量也较低；且CS组的血糖浓度明显低于AH组，在CS组的瘤胃中，乙酸与丙酸的比例和氨氮的浓度均显著高于AH组（表1）。
2. 基于宏基因组学的AH和CS组之间瘤胃微生物的组成和功能差异
从瘤胃微生物群中共鉴定出784个属水平微生物，包含了古细菌，细菌和真核微生物，在所有奶牛中检出111个属微生物。将CS组与AH组比较发现，变形杆菌门，纤维杆菌门和黏胶球形菌门的相对丰度（图1a）和拟杆菌属，副拟杆菌属，纤维杆菌属，卟啉单胞菌属，Paludibacter和Victivallis属的相对丰度显着较高（P <0.05），而密螺旋体属和琥珀酸单胞菌属在CS组瘤胃中，相对丰度与AH组相比显著降低（P <0.05）（图1b）。在396个优势细菌种类中，仅在AH组的瘤胃中发现了嗜麦芽糖密螺旋体（Treponema maltophilum）相对丰度较高，而嗜糖密螺旋体在CS组的瘤胃中的相对丰度则显著降低（P <0.05）。在两组间的属或种水平上，古细菌和真核生物的丰度均未发现差异。宏基因组功能分析揭示了两组在1级基因功能中碳水化合物代谢的相对丰度不同（图1c，）。碳水化合物代谢中第4级功能的比较表明，乳醛还原酶，I型谷氨酰胺合成酶，甲基丙二酰辅酶A脱羧酶，琥珀酸脱氢酶的基因相对丰富和α-木糖苷ABC转运蛋白在CS组中显著降低（图1d）。
3. 基于宏基因组和代谢组联合分析AH和CS组瘤胃微生物代谢差异
在瘤胃液中55种代谢产物中，CS组中49种的代谢产物含量较低，其中有17种为微生物代谢产物。通过将微生物分类单元的相对丰度，碳水化合物代谢中的基因丰度和17种微生物代谢物关联起来，研究了微生物代谢物与微生物之间的关系。核心宏基因组学相关因素包括三个细菌属（纤维杆菌属，密螺旋体属和琥珀酸单胞菌属），三个细菌种类（溶淀粉琥珀酸单胞菌Succinimonasamylolytica，Treponemasuccinifaciens和糖密螺旋体T. saccharophilum）和三个微生物功能（甲基丙二酰-CoA脱羧酶，琥珀酸脱氢酶，乳醛还原酶）（图2a）。
琥珀酸脱氢酶基因和溶淀粉琥珀酸单胞菌的相对丰度分别与16种代谢物（r的范围为0.43至0.68，P <0.1）和15种代谢物（r的范围为0.43至0.76，P <0.1）呈正相关。在CS组中，瘤胃中产生较低的丙酸和较高的乙酸的潜在机理见图2b。瘤胃细菌密螺旋体属，糖密螺旋体T. saccharophilum，Treponema succinifaciens，嗜麦芽糖密螺旋体（仅在AH中鉴定）、琥珀酸单胞菌属和溶淀粉琥珀酸单胞菌的相对丰度降低；乙醛还原酶，I型谷氨酰胺合成酶，琥珀酸脱氢酶和α-木糖苷ABC转运蛋白基因功能下调导致CS饲喂的牛瘤胃中丙酸比例降低（P <0.01）（图2b）。此外，纤维杆菌纲，纤维杆菌属较高的相对丰度和甲基丙二酰-CoA脱羧酶功能上调，导致在CS组的瘤胃中乙酸比例更高（图2b）。
4. AH和CS组的肝和乳腺组织代谢差异
代谢物谱分析分别在肝脏和乳腺组织中鉴定了270和273种代谢产物（重叠179种）。在CS组中，肝脏中28种代谢产物的丰度差异显著（VIP> 1＆P <0.05）；其中15个代谢物相比AH组较少，13个代谢物则较多。在乳腺组织中，CS组中有3种代谢物的丰度较低，6种代谢物的丰度较高。
生成单个代谢物的ROC曲线用于生物标记分析。图3显示了肝脏和乳腺组织中AUC（ROC曲线下面积值）最高的前3种代谢产物及其在AH和CS组中的相对浓度。肝脏中马尿酸（AUC = 1；图3a），亮氨酸（AUC = 1；图3b），胱氨酸（AUC = 0.972；图3c）表现出最佳的预测性能，可以区分AH和CS组。乳腺中的马来酸（AUC = 0.972；图3d），邻苯三酚（AUC = 0.833；图3e）和琥珀酸（AUC = 0.833；图3f）是分离AH和CS组的潜在生物标志物。CS组的显著下调关键途径是肝脏中的氨基酸代谢，糖异生和维生素和矿物质代谢（图3g）和乳腺中的AAs、L-AA的摄取，碳水化合物代谢和葡萄糖-6-磷酸的氧化（图3h）。
5. AH和CS组之间差异表达基因和功能分析
在肝脏和乳腺转录组中分别获得了的22.63±1.95和20.03±271万的原始序列读数。基因表达的密度在每个组织内的饮食处理之间没有显示出明显的差异，但是在两个组织之间存在显著的差异，这表明肝脏中CPM> 10的基因比乳腺的要多。在肝脏和乳腺中总共鉴定出18,215和18,004个基因，在肝-AH，肝-CS，乳腺-AH和乳腺-CS组中分别表达11,584±464,11,655±303、10,458±353和10,576±335个基因。在肝-AH，肝-CS，MG-AH和MG-CS组。在AH和CS组之间，总共在肝脏中发现了67个基因（CS组中有9个上调，而58个下调了）差异基因（图4a）。在CS组的乳腺中，两个基因（IGFBP1和ENSBTAG00000047957）以及六个基因（包括PDZK1IP1，LALBA，CSN1S2，LOC505033，CSN3和PDPN）分别显著上调和下调（图4b）。基于差异基因，在AH和CS组之间分别在肝脏和乳腺组织中鉴定出165个和19个功能性GO项，其中，分别有4项和10项GO在肝脏和乳腺中显著富集。
讨论
与AH相比，CS的非纤维性碳水化合物含量较低，这主要是因为其中果胶含量较低，密螺旋体可以降解果胶，据报道瘤胃中密螺旋体的丰度与饲料中果胶的含量密切相关。在CS组中，瘤胃中的密螺旋体属和T. saccharophilum，T. succinifaciens的相对丰度较低，这可能导致丙酮酸生成量降低。在CS组的瘤胃中，其他果胶降解细菌（如琥珀酸纤维杆菌）、琥珀酸属，溶淀粉琥珀酸单胞菌和琥珀酸途径的相对丰度往往较低，这表明CS还可以下调琥珀酸生产中的微生物功能，而这是丙酸生物合成的重要中间代谢产物。此外，CS组的瘤胃中乙酸含量较高，可能是由于能够分解纤维素的纤维杆菌的含量较高，其能够利用NDF产生乙酰辅酶A，进而通过甲基丙二酰辅酶A脱羧酶生成乙酸。这些发现表明，CS中的营养成分驱动瘤胃微生物组的转变，而宿主的可用底物因此发生了变化。
同时，瘤胃微生物代谢产物的改变可能影响肝脏和乳腺的功能，例如，瘤胃中产生的丙酸被运输到肝脏，其中大部分通过糖异生作用转化为葡萄糖，这一生物过程最多可为反刍动物提供80％的葡萄糖需求维护和生产。CS限制了两个肝脏共和乳腺的代谢和生物学功能，这导致动物性能下降，遗传变异可能会调节乳腺中蛋白质加工所涉及的基因。首先，代谢物的改变显示肝脏糖异生明显减少，乳腺血浆流量和血糖浓度较低，这表明可能无法为牛奶合成维持足够的葡萄糖供应，导致乳腺生产牛奶减少。其次，CS组中血液的AA代谢组的丰度较低，同时14种AA及其衍生物的含量降低，可能导致乳腺中蛋白质加工和合成的减少，导致牛奶蛋白产量降低。
在两组之间，AA代谢途径是肝脏中最显著不同的途径（图5a）。对AA代谢途径的进一步影响分析表明，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢的影响最大（图5b）。因此，对肝脏中与甘氨酸相关的反应进行了彻底的分析，并研究了它们与体内体液中代谢物的关系。综合比较表明，苯甲酸、马尿酸和胍基乙酸（GAA）在整个人体的AA代谢中起关键作用，在CS组中，其随后可能影响牛奶的合成（图5c）。GAA是肌酸的前体，它是能量代谢的重要底物。肝脏中产生的较低的GAA可能会减少CS组中乳腺的能量供应（图5c）。苯甲酸是一种在胃肠道产生，被转运到肝脏的，与甘氨酸反应生成马尿酸，但是它也可以在瘤胃中代谢形成2,3-二羟基苯甲酸，而仅在AH组的瘤胃液中检测到2，3-二羟基苯甲酸。CS组的肝脏中甘氨酸和马尿酸的浓度较高表明瘤胃和肝脏的苯甲酸代谢都可能受到影响（图5c）。马尿酸主要通过苯甲酸和甘氨酸的结合在肝脏中产生，并作为主要的含氮成分之一排泄到尿液中。此外，马尿酸仅在CS组的肝脏中检测到，其血清和尿液中的相对浓度均显着较高（图5c）。对肝脏，血清和尿液进行的马尿酸生物标志物分析显示出一致的结果（图5d），这进一步表明，从肝脏到尿液的马尿酸循环是CS组牛奶产量变化的生物标志物。
除确定对牛奶生产产生负面影响的机制外，基于多组学的方法还确定了CS的潜在正面影响。在使用CS喂养的奶牛中，牛奶中的百里酚含量明显更高。百里酚是一种酚，具有令人愉悦的芳香气味和强大的防腐性能。此外，CS组的牛奶中β-乳球蛋白含量明显更高。β-乳球蛋白是牛奶中的主要乳清蛋白，对人类具有很高的生物学价值。牛奶中有益的生物活性成分（百里酚和β-乳球蛋白）增加，这表明CS可能是生产高质量牛奶的潜在解决方案。
总结
该研究首次利用多组学技术研究瘤胃，肝脏和乳腺三个关键器官的生理与代谢机制，整体系统的研究牛奶生产过程，为系统生物学在奶牛营养研究的应用提供了全新思路。此外，系统研究饲喂玉米秸秆日粮奶牛泌乳性能低下的代谢分子机理，首次揭示基于四种体液的系统代谢机理和瘤胃中丙酸下降的微生物代谢机制，提出了玉米秸秆日粮下奶牛肝脏和乳腺的代谢和基因表达图谱，阐明了奶牛乳产量和乳蛋白低下的关鍵原因，为低质饲草利用的基础研究提供了参考。并发现马尿酸是导致牛奶产量低的代谢生物标志物，暗示了与低质饲草利用代谢机制有关的未来评估参数。
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