Nature Microbiology | 抗生素引起的霍乱弧菌生物膜降解破坏了群落屏障功能
推荐：江舜尧
编译：小范儿
编辑：小菌菌
自然界中的细菌细胞经常接触变化的化学环境，分离出的细胞对这种环境刺激的反应机制已有详细研究。而对环境变化所产生的紧急的多细胞反应知之甚少，而这是了解最常见细菌群落生物膜结构和功能的关键。文中将霍乱弧菌暴露在通常用于霍乱感染的抗生素中，监测霍乱弧菌生物膜的所有单个细胞，发现转化酶抑制剂对细胞的大小和形状产生显著的影响，影响生物膜的结构特性。抑制蛋白质合成的代谢结果引起单细胞水平反应，而群体水平反应是基质组成、基质分解和细胞之间的机械相互作用的共同作用结果。我们进一步观察到，在抗生素诱导后，通过使噬菌体和不同物种的入侵细胞入侵生物膜对生物膜结构的变化（包括生物膜种群动态和群落聚集）有实质性的影响。这些生物膜接触抗生素所引起的机械原因和生态结果是了解细菌对环境变化的群体反应的重要一步，对探讨抗菌药物对生物膜群落生态演替的影响具有重要意义。
文中重要图片说明
图1 | 抑制蛋白质合成会引起生物膜的结构改变。
a.原始显微镜图像基于24小时生物膜mKOκ荧光和细胞的三维可视化酒香分割后的椭圆，用一个黄色的轮廓在中间分开。
b.四张图片第一张粉红色的框被放大见a图，显示在最小抑菌浓度的四环素处理6小时内3D追踪5个细胞，根据它们的体积着色，背景中的其他细胞都是灰色。四环素治疗可使细胞体积增大，细胞密度(体积分数)降低。
c.按照四环素（Tet）处理时间顺序的一组生物膜结构动力学的照片。
d.生长相同时间的生物膜，经四环素处理与未经四环素处理的细胞体积、长宽比和密度变化。数据为平均值（- Tet样品n=15，+Tet样品n=9）使用未配对双侧t检验计算相对于对照生物膜的统计显着性（**** P <0.0001）
e-h.四环素处理组(e)和未处理组(f)细胞平均体积和细胞密度随时间的变化。四环素处理(g)或未处理的对照组(h)的细胞密度随时间的变化。根据给定时间的平均细胞体积或细胞密度以及生物膜中的空间位置，对这些热图中的每个像素进行着色。所有生物膜和生长介质（即生物膜边界）相距相似距离的细胞，对细胞体积和细胞密度值取平均值。热图代表n=5个不同的生物膜。
图2 | 四环素处理细胞的持续代谢活动导致细胞体积的扩大。
a. 经四环素处理或不处理后微流体装置中表面附着生长的分离细胞和液体培养的游离细胞的细胞体积倍数变化，以0 h未经处理的细胞体积为标准，数据是平均值±标准误，n = 3个独立重复。
b-d. 四环素处理的细胞具有代谢活性，如未被标记的己糖6-磷酸（糖酵解的第一个中间体）（b）、磷酸烯醇丙酮酸（糖酵解的后期）的（c）和d-丙氨酰-d-丙氨酸（细胞壁前体）（d）的比例所示。将四环素处理2小时的细胞(蓝色)或未处理的对照细胞(红色)用C13标记的培养基洗涤不同时间，范围为0-150 s(平均值±标准差，3个独立重复)。
e. 四环素处理和未处理的细胞六磷酸己糖、磷酸烯醇丙酮酸和d-丙氨酰-d-丙氨酸浓度的变化倍数（平均值±标准误，n = 3个独立的重复）。
f. 四环素处理和未处理对照细胞的能量电荷，使用（[ATP] + 0.5 [ADP]）/（[ATP] + [ADP] + [AMP]）计算（平均值±标准误，n = 3个独立的生物学重复））
g. 经四环素，甲氧苄啶（Tmp）或四环素和Tmp处理，经去除（-glc）葡萄糖处理或葡萄糖去除和四环素处理（-glc+ Tet）的生物膜的细胞体积和细胞密度（以体积分数衡量）的倍数变化。数据用均数±标准误表示，样本大小(n)为17(仅限Tet)、5(仅限Tmp)、6 (Tet + Tmp)、3(−glc)和4(−glc + Tet)，每个样本对应一个不同的生物膜。每种处理的倍数变化是以0h为参照。
在a和g中，使用多次比较的单向方差分析（ANOVA）计算统计显着性。在e和f中，使用双向不配对t检验计算统计学显着性。 a中的统计上无显着性差异（NS）：P = 0.067、0.99、0.24和0.78（从左到右）；在e中：P ＝ 0.076、0.071和0.99（从左到右）；在f中：P = 0.70; 在g中：P ＝ 0.99。 * P ＜0.05，*** P ＜0.001和**** P ＜0.0001。
图3 | 抗生素诱导的生物膜结构破坏
a. 在抗生素治疗过程中，基质的运动可以通过附着在基质上的荧光珠来观察，表达sfGFP荧光蛋白(青色)的细胞生长含有直径0.1μm荧光珠(红色)的培养基中，有时珠子会被植入生物膜基质中，在四环素处理期间，没有新的颗粒进入生物膜，放大的插图显示四环素处理过程中红色珠簇分离，表明基质的差异运动。图像代表了n = 3种不同的生物膜
b. 与未经处理的生物膜相比，基质蛋白缺失突变体生物膜的细胞体积和细胞密度（以体积分数衡量）倍数变化。数据是平均值±标准误，n=15 (WT, −Tet), 9 (WT, +Tet)， 10 (ΔrbmC，−Tet)，10 (ΔrbmC， +Tet), 15 (Δbap1，−Tet)，8 (Δbap1, +Tet)18 (ΔrbmA，−Tet), 11 (ΔrbmA， +Tet)；样品对应于不同的生物膜。
c. 不同构象的RbmA突变体（D97A，D97K和R234A）的细胞体积和细胞密度倍数变化。数据显示为平均值±标准误。 n =15（WT，-Tet），9（WT，+ Tet），16（D97A，-Tet），19（D97A，+ Tet），19（D97K，-Tet），10（D97K，+ Tet）， 9（R234A，-Tet），10（R234A，+ Tet）18（ΔrbmA，-Tet）和11（ΔrbmA，+ Tet）；样品对应于不同的生物膜。
d. 抗生素处理期间，细胞（使用mTFP1标记为青色）与基质（使用RbmA–His荧光抗体标记为黄色）分离。放大插图显示单个细胞在四环素处理期间从RbmA上脱离（由红色箭头指示，在两个面板中显示生物膜的相同区域）。图像代表n = 5种不同的生物膜。
e. 热图显示在四环素处理(左)和未处理(右)生物膜中，每个细胞生物膜边界周围的平均RbmA-His免疫荧光随时间变化。热图代表n ＝ 5个不同的生物膜。
f. ΔrbmA背景下的细胞密度。数据为平均值±标准误，n = 7（0％阿拉伯糖），12（0.2％），11（0.3％），16（0.5％），10（1％），18（2％）和14（5％）样品;样品对应于不同的生物膜。
g. ΔrbmA背景下生长的生物膜的细胞密度倍数变化（对比四环素处理6 h和0 h）数据为平均值±标准误，n = 5（0％阿拉伯糖），12（0.2％），11（0.3％），16（0.5％），10（1％），18（2％）和14（5％）; 样品对应于不同的生物膜。
h. 模拟生物膜的热图，其在7 h后细胞间吸引力呈线性下降（左），在6 h后细胞体积呈线性增加（中间）或细胞的吸引力降低而细胞体积同时增加（右） n = 3次模拟运行。
i. 缺乏参与加工基质蛋白RbmA或RbmB蛋白酶的菌株的生物膜经四环素处理细胞体积和细胞密度的倍数变化。(平均值 ± 标准误， n=17 (WT), 8 (ΔhapA), 16 (ΔprtV), 3 (ΔivaP) and 15 (ΔrbmB))
j. 经IPTG诱导携带Ptac :: rbmB的质粒或空载体的野生型生物膜细胞密度的倍数变化（平均值±标准误，Ptac :: rbmB为n = 16，对照为n = 11）
图4 | 经过抗生素处理的生物膜容易被细菌定植和入侵。
a. 霍乱弧菌野生型生物膜共聚焦xy切片，组成性表达mKOκ（黄色细胞），驻留的生物膜经过四环素处理6小时，然后入侵细胞（蓝绿色）处理2小时，该细胞除了表达荧光蛋白（sfGFP代替mKOκ）与生物膜有相同的基因型。之后更换无菌培养基开始成像（将此时定义为0时刻），0 h的成像显示生物膜被入侵细胞定植，使用免疫荧光(红色)可以观察到RbmA。另一个成像显示了游离细胞已定居在生物膜上的位置，以距生物膜边界的距离来衡量。
b. 一个对照组霍乱弧菌生物膜的共聚焦图片（未用抗生素处理），用入侵细胞处理相同的时间，很少有细胞附着在玻璃表面
c. 在霍乱弧菌生物膜入侵过程中，入侵生物量除以常驻生物量的量化比。数据为平均值±标准误。+ Tet为n = 8，对照条件为n = 11。
d. 按照与a相同的方法，经铜绿假单胞菌和四环素共同处理或未处理的霍乱弧菌生物膜共聚焦xy切片。图像代表了12种不同的生物膜。
e. 铜绿假单胞菌入侵生物量除以霍乱弧菌常驻生物量的数量比；数据为平均值±标准误，例如，+ Tet为n = 12，对照为n =11。
f. 按照与a相同的方法，腐菌入侵经四环素处理或未处理的霍乱弧菌生物膜共聚焦xy切片。图像代表八种不同的生物膜。
g. 腐烂入侵生物量除以霍乱弧菌常驻生物量的数量比；平均值±标准误，+ Tet为n = 12，对照为n = 8。
h. 噬菌体N-4病毒粒子和四环素共同处理或未处理6 h N-4噬菌体数量随位置变化的定量分析。数据为平均值±标准误，例如，+ Tet为n=5，对照为n=3。
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