科研 | mBio：不同土壤深度和植被类型下土壤细菌的次生代谢潜力
编译：YQ，编辑：小菌菌、江舜尧。
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次生代谢物是微生物产生的对细胞生长有益的辅助化合物，许多土壤微生物能合成次生代谢物，在营养获取、细胞交流、与周围生物和环境互作时发挥作用。这些化合物包括抗生素、群体感应分子、免疫抑制剂、降解酶。次级代谢物具有重要生物化学用途，在医药和生物技术领域广泛应用。大多数已知的抗生素来自放线菌、变形菌门、厚壁菌门。由于土壤微生物复杂多样，大多数类群未被描述，这使土壤微生物类群及其次生代谢产物有巨大研究潜力。
次生代谢物是由生物合成基因簇（BGC）共同作用合成的，非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）是两大类BGC，合成抗生素和抗菌药物。NRPS包含缩合结构域（CD）和腺苷酸结构域（AD），PKS包含酮缩酶结构域（KS）和其他多种结构域。这些结构域可用于识别基因簇，其丰度可作为生物合成潜力的参考。对于环境变量对土壤次生代谢产物的影响的研究甚少。研究表明NRPS和PKS丰度在干旱土壤中较高，在森林土壤中较低。次生代谢产物的组成与大陆纬度、植被类型、城市/非城市都有关。这些研究依赖于设计已知基因簇的引物进行PCR扩增，因此仅能得到已知结构域相似的序列。相比之下，宏基因组学能够在系统发育的背景下获得不同的序列。近年来，宏基因组在酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门的研究中获得新的生物合成基因簇。
本研究假设土壤深度、植被类型、基岩岩性、降雨量影响土壤细菌次生代谢，这些细菌依赖次生代谢产物进行种间竞争和生态响应。在三个生态系统中对土壤进行采样：草甸草原，附近的森林山坡（相同的基岩岩性），丘陵草原（不同的基岩岩性），共获得129个宏基因组数据，从中搜寻BGC，对比分析多门土壤细菌的生物合成潜力，并提出土壤细菌的次生代谢随土壤类型和环境条件的变化，对未来次生代谢生态学和自然产物开发至关重要。
论文ID
原名：Bacterial Secondary Metabolite Biosynthetic Potential in SoilVaries with Phylum, Depth, and Vegetation Type
译名：不同土壤深度和植被类型下土壤细菌的次生代谢潜力
期刊：mBio
IF：6.784
发表时间：2020.06
通信作者：Jillian F. Banfield
通信作者单位：美国加州大学伯克利分校
实验设计
本研究采样方案（2013-2016年，3个地点）。Angelo：草甸样品，蓝色表降雨天气，数字显示每个时期的不同土壤深度下在自然区域和人工降雨区域的采样数量；Rivendell：样品来自一棵花旗松和浆果鹃，数字代表每个深度的样品数量；Sagehorn：样品取自一棵奥里根白栎和周围的丘陵草地。
结果
1、微生物群落结构
为比较不同土壤深度、不同植被类型、不同基岩岩性下的微生物群落组成，本研究使用核糖体蛋白rpS3序列作为标记基因识别不同菌种。rpS3是保守的单拷贝基因，相对于基因组组装可以更好地区分微生物类群。rpS3分析表明该区域（鳗鱼河临界区天文台）的优势细菌是变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门，不过不同的采样点和土壤深度的微生物群落存在差异（图1A）。古生菌丰度较高，在一些样品中占30%。候选门级辐射类群（CPR）细菌在多数样本中低丰度（约1%），除了草甸样品。花旗松和浆果鹃中酸杆菌门丰度较高，而放线菌门在丘陵的土壤深处丰度较高。在草甸草原，古生菌和硝化螺旋菌门在土壤深处丰度较高。
从环境特征上看，采样地点、土壤深度、植被类型对微生物群落的组成均有显著影响。在同一采样地点，土壤深度和植被类型的边际影响程度相似（图1B），这些影响程度体现在非度量多维尺度下样本点的聚类上，植被类型和土壤深度均造成样本点的扩散。此外，结果表明基岩岩性、自然或人工降雨对微生物群落的影响不大。
图1 微生物群落结构。A：基于核糖体蛋白pS3的微生物门识别和相对丰度，样品按采样地点、采样时间、采样环境、土壤深度分组；B：每个样品微生物群落的非度量多维尺度分析。
2、基因组组装与生物合成潜力差异
本研究从129个宏基因组组装并过滤后获得了1334个全基因组（MAG），其中374个为高质量基因组草案，941个为中等质量基因组，这些基因组包括22个细菌门，其中大多数具有一定的生物合成潜力（图2）。在基因组中共识别3175个生物合成基因簇，侯选门Candidatus Rokubacteria的所有基因组都具有中等数量的生物合成基因簇（图3A）。其他细菌门，如放线菌门和绿弯菌门的个别基因组具有异常高数量的生物合成基因簇。先前研究表明非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）基因簇会出现短片段错误组装的情况，而本研究发现有1100个缩合结构域（CD）和939个聚酮合酶（PKS）包含在>10kb的重叠群中，具有可靠性，这表明微生物基因组中有许多生物合成基因簇没有被分析。每个基因组中，酮缩酶结构域（KS）和缩合结构域（CD）的数量因门而异（图3B-C）。侯选门CandidatusRokubacteria有中等数量的酮缩酶结构域（KS），少数基因组有大量缩合结构域（CD），而酸杆菌门有大量保守的缩合结构域（CD）。
本研究发现的生物合成基因簇最多的基因组是放线菌门链球菌（Streptosporangiales_ANG_2），在40cm深度的丘陵草原土壤中。从草甸草原20cm土壤采集的一个绿弯菌门纤线杆菌属基因组（Ktedonobacter_ANG_387）有最多的酮缩酶结构域（KS）。缩合结构域（CD）最多的是采自草原土壤20cm的一个酸杆菌门基因组（Eelbacter_gp4_AA13）。高数量生物合成基因簇或酮缩酶结构域（KS）的类群包括放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门。酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、δ变形菌门、β-变形菌门、拟杆菌门基因组含有大量缩合结构域（CD）。
本研究发现的最常见生物合成基因簇是萜烯、非核糖体肽合成酶（NRPS）/聚酮合酶（PKS）、细菌素。基因组中的生物合成基因簇类型取决于门水平分类。梯形烷、套索肽、吲哚、膦酸酯在总体基因组中不常见（图3D），但在某些门中常见。比如细菌素在芽单胞菌门中比例较高，梯烷在疣微菌门中常见，膦酸酯在硝化螺旋菌门中富集。本研究发现放线菌门的几个新演化支的基因组拥有大量非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）基因簇，包括草原中的五个小单孢菌纲基因组和两个奥里根白栎的假诺卡氏菌属基因组。放线菌门上两个新的分支具有大量酮缩酶结构域（KS）和缩合结构域（CD）基因簇，他们基因组尺寸大（7-8Mbp），GC含量高（>70%），与常见放线菌基因组不同，这些支链可能是链孢菌纲的一个新科，其中包括最多生物合成基因簇的链球菌基因组（Streptosporangiales_ANG_2）。
本研究发现候选门级辐射类群基因组有3种生物合成基因簇，先前研究并未发现。小基因组菌总门基因组Microgenomates_ANG_786编码一个抗肽，螺旋体菌门Saccharibacteria_ANG_806编码一个萜烯，Microgenomates_ANG_785编码一个偶氮唑肽（LAP）生物合成基因簇。偶氮唑肽属于核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPP）天然产物家族，功能为核糖体前体肽合成及其翻译后修饰（PTM），这个基因簇包括三个PTM酶基因，为YcaO、硝基还原酶、肽酶（图4）。YcaO基因旁边存在一个假定的84个氨基酸肽前体。YcaO的产物是一种环化脱水酶，将核心肽区的丝氨酸和胱氨酸残基修饰为偶氮化合物，随后被硝基还原酶基因编码的黄素单核苷脱氢酶氧化成氮唑，最后肽酶裂解前体肽并释放天然产物。本研究在93个候选门级辐射类群基因组中发现110个偶氮唑肽（LAP）生物合成基因簇，表明LAP簇合在CPR中广泛存在，其中89个LAP簇的YcaO基因周围含硝基还原酶基因。
图2 基于核糖体蛋白的系统发育分析。颜色代表分类组，堆叠条形图表示每个基因组中的酮缩酶结构域（KS）和缩合结构域（CD）的数量。
图3 分类组的生物合成基因簇和相关基因簇。A：每个基因组的生物合成基因簇数量；B-C：每个基因组的酮缩酶结构域（KS）和缩合结构域（CD）数量；D：分类组中各类生物合成基因簇的比例。
图4 候选门级辐射类群基因组Microgenomates_ANG_785预测的偶氮唑肽的生物合成基因簇
3、不同深度和植被的生物合成潜力
因为土壤深度是影响微生物群落组成的重要因素，因此研究生物合成潜力差异。土壤深度作为连续型变量，使用DESeq分析每种微生物的丰度变化趋势。1334种细菌中，其中320种随深度显著增加（深富集），343种随深度显著减少（浅富集）。大多数分类类群都有深富集或浅富集成员（图5A），古生菌和硝化螺旋菌门主要是深富集，而丙型变形菌纲主要是浅富集。若比较深富集和浅富集的每个基因组的BGC、KS、CD基因簇平均数量，可看出浅富集的基因组BGC、KS基因簇较多（图5B），而BGC总体类型没有显著差异。除土壤深度外，上覆植被类型对土壤微生物群落的生物合成潜力有重要影响（图5C）。草地样本中显著富集的基因组有399个，树木样本富集有298个，其中BGC差异不显著，但草地富集基因组编码的KS结构域多于树木样本（图5D）。在某些采样点和土壤深度，带有15个以上KS/CD结构域的基因组显著富集，而在其他采样点完全丧失（图6）。草甸草原土壤普遍存在生物合成潜力最高的酸杆菌门，放线菌门在草原中富集程度显著高于树木，其中生物合成潜力最高的亚群在丘陵中富集。
图5 不同土壤深度和植被下的细菌基因组、生物合成基因簇及其关键结构域的丰度比较。A-B：每个分类组中在土壤深富集（蓝色）、浅富集（红色）、无差异（灰色）的基因组数量，以及每个基因组生物合成基因簇、KS、CD结构域的平均数目；C-D：草地环境（绿色）和树木覆盖环境（紫色）富集的各分类组中的基因组，以及每个基因组生物合成基因簇、KS、CD结构域的平均数目。
图6 高生物合成潜力的基因组的采样地点。选择含有15个以上生物合成结构域的基因组，热图颜色代表丰度差异，右边颜色栏表示每个类群的环境富集趋势。
讨论
1、高生物合成潜力的系统发育群
本研究发现放线菌门基因组BGC、KS、CD结构域数量最多，而且多为新分支物种，且在草地土壤富集。先前16S rRNA扩增子研究发现放线菌丰度与NRPS和KS结构域的相关性。因此，放线菌及其生物合成基因簇的富集受土壤植被类型影响。另一种高生物合成潜力的细菌是绿弯菌门，这类细菌在全球土壤中很常见，具有庞大基因组的多样性，在热带森林土壤和海洋的类群具有PKS结构域，本研究发现其中的纤线杆菌属具有14个NRPS或PKS结构域。这表明纤线杆菌表达的化合物表现广泛的抗菌活性。
2、生物合成基因簇的功能
虽然萜类化合物是BGC中含量最多的一类，但它们在细菌中的生态功能仍未知。研究表明细菌中的一些萜烯类化合物进行细胞间交流，也可以和真菌交流，其中一些具有抗菌功能。许多萜烯类化合物具有挥发性，能够穿过空气和湿性土壤间隙。本研究发现的不同土壤细菌基因组的广泛萜烯类合成酶的功能有待进一步研究。本研究发现的另一个丰富BGC是NRPS和PKS基因簇，其功能与抗生素、抗真菌素、免疫抑制、铁鳌合等相关。此外，细菌素基因簇也普遍存在土壤细菌中，其功能与抑制其它微生物生长、在同一生态位减少竞争有关。
本研究发现疣微菌门中的梯烷合成基因簇富集，梯烷是厌氧氨氧化细菌的细胞膜组成部分，先前研究仅发现于浮霉菌中，因此这里发现的梯烷合成基因簇可能具有未知功能。此外，吲哚作为微生物破坏植物病原的群体感应和毒力的功能产物，在本研究中富集于丙型变形菌纲中，而磷酸酯BGC富集于硝化螺旋菌门中，且随土壤深度增加而富集。
3、微生物生物合成潜力随土壤深度和植被的变化
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