科研 | Cell：肠道菌群介导生酮饮食的抗癫痫作用
本文由周珊编译，董小橙、江舜尧编辑。
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提到神经类疾病，他们首先考虑的是大脑出了什么问题，而不是肠道。然而，越来越多的研究表明，肠道和大脑之间存在着一种重要的联系，这种联系被称为“肠-脑轴”。微生物群也越来越多地与神经传递相关因素的变化有关，包括神经递质信号、突触蛋白表达、长期增强和髓鞘化，以及各种复杂的宿主行为，包括压力诱导行为、社交行为和认知行为。近年来，研究人员在小鼠模型上发现肠道微生物与一些脑部疾病，如焦虑症、自闭症谱系障碍等相关，可作为潜在的治疗靶点，人们对“肠-脑轴”越来越感兴趣。
癫痫大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。国内总体患病率为4.0-7.0‰；据WHO统计，全世界有5000多万人患有癫痫。癫痫可能的致病原因有遗传，脑损伤，感染等，但大部分均为不明原因的特发性癫痫。生酮饮食（Ketogenic Diet ,KD）是一种低碳水化合物高脂饮食，主要用于治疗难治性癫痫，然而由于实施困难、饮食依从性和不良反应，KD的临床应用并不广泛。许多研究提出了酮、γ-氨基丁酸（GABA）调节和线粒体间变性在介导KD的神经效应方面的作用，但KD对大脑活动和行为产生有益影响的机制尚不清楚。
肠道微生物是食物和宿主生理之间的重要中介，肠道微生物的种类组成和功能是由食物决定的，向宿主提供的营养依赖于微生物的代谢。有研究报道KD可改变小鼠的肠道菌群；酮症与人体肠道微生物改变有关；更值得注意的是，有研究发现抗生素的服用增加了癫痫患者发作的风险，表明微生物在减轻癫痫发作可能性方面可能发挥作用。根据新出现的将肠道微生物群与宿主对饮食、新陈代谢、神经活动和行为的反应联系起来的研究，Elaine Y. Hsiao等人假设肠道微生物群会影响KD的抗癫痫作用并精心设计实验来探索KD的抗癫痫作用与肠道微生物的关系。在两种小鼠模型上的结果表明，KD可改变肠道微生物的组成从而产生抗癫痫作用，使用抗生素或无菌饲养的小鼠对KD的癫痫保护作用消失，而将与KD相关的Akkermansia和Parabacteroides共同移植到无菌小鼠，可恢复KD的抗癫痫作用。此外他们还发现结肠腔内容物、血清和海马代谢谱的改变与KD的癫痫保护作用有关，包括全身GG-氨基酸的减少和海马GABA/谷氨酸水平的升高。相关细菌的交叉喂养降低了γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的活性，抑制γ-谷氨酰化从而产生抗癫痫作用。总之，这项研究揭示了肠道微生物对小鼠体内宿主代谢和癫痫的调节作用，为癫痫的治疗提供新思路。
原名：The Gut Microbiota Mediates the Anti-Seizure Effects of the Ketogenic Diet
译名：肠道菌群介导生酮饮食的抗癫痫作用
期刊：Cell
IF：31.398
发表时间：2018年
通信作者：Elaine Y. Hsiao
通信作者单位：加州大学洛杉矶分校综合生物学与生理学系
实验设计图
1、生酮饮食改变肠道菌群
6-Hz模型对多种抗癫痫药物具有抗药性，可作为研究药物筛选的难治性癫痫模型，他们以脂肪：蛋白质（6：1）的生酮饮食或维生素和矿物质相匹配的对照饲料（CD）喂养常规定植SPF的瑞士韦伯斯特小鼠。与CD对照组相比，6 Hz刺激引起小鼠惊厥阈值升高（图1.A），血糖降低（图1.B），血清b-羟基丁酸（BHB）升高（图1.C）。与KD组相比，CD组的食物消耗量和体重增加没有显着性差异。除了提高惊厥阈值外，KD还改变了肠道微生物群的组成（图1.D）,在每个时间点（图1.E）观察到α多样性下降，表明KD引起的特定细菌分类群的损失。其中Akkermansia muciniphila的相对丰度在4天和14天的饮食治疗期间显著上升（图1.F）,从2.8% ± 0.4% 到36.3% ± 2.8% （mean ±SEM）；Parabacteroides、Sutterella和dsipelotrichaceae也显著增加。这些结果表明，肠道微生物群的组成确实改变了KD的治疗响应。
图1.生酮饮食改变肠道微生物群预防6-Hz模型诱导的癫痫发作
2、肠道微生物群对于KD的抗癫痫作用是必要的且充足的
为了确定肠道微生物群对KD的抗癫痫作用是否必需，他们测量了无菌小鼠（GF）或用抗生素（Abx）治疗的小鼠的6-Hz惊厥阈值，结果发现KD的抗癫痫作用GF小鼠（图2.A）和Abx处理的SPF小鼠（图2.C）中未出现，表明肠道菌群是KD介导的癫痫保护作用所必需的。将SPF小鼠的粪便喂养给GF小鼠后，恢复了KD的癫痫保护作用（图2.A），提示肠道菌群通过与断奶前发育过程无关的途径介导癫痫的保护。值得注意的是，肠道菌群恢复了抗癫痫的作用，但与血清BHB或血糖水平的变化无关（图2.B和2.D），而且肠道、肝脏或脑BHB水平在各组间没有显著差异。这与前人的一些结果一致：BHB的浓度不一定与癫痫的保护有关，酮症可能是必要的，但并不足以控制KD介导的癫痫发作。以上数据表明，在6-Hz惊厥模型中，肠道微生物群是KD抗癫痫作用所必需的，并表明肠道微生物不通过改变BHB水平的来调节的癫痫易感性。
图2.肠道菌群是KD抗惊厥作用所必需的
随后他们研究了选择性富集KD相关肠道微生物的小鼠的癫痫易感性。单用KD处理可使惊厥阈值从CD小鼠的19.4±0.8 mA升高到24.2±0.3 mA（提高24.5%），而Abx处理的KD喂养小鼠则消除了这种抗癫痫效应（图3.B）；A. muciniphila 和Parabacteroides的联合应用恢复了KD对Abx处理后小鼠的惊厥保护作用（图3.A AkkPb KD组），使Abx小鼠的阈值从19.9±0.3 mA提高到27.0±0.5 mA（提高了36.0%）；而单用A. muciniphila 或Parabacteroides后，癫痫发作阈值无明显增加（图3.BA Akk KD组及Pb KD组）；Bifidobacterium治疗也无效果（图3.A Bf KD组）；表明A. muciniphila 和Parabacteroides这两个菌属是KD介导的抗癫痫作用所必需的。进一步在GF小鼠中验证了A. muciniphila 和Parabacteroides的协同作用（图3.B）。综上所述，这些发现揭示了KD小鼠A. muciniphila 和Parabacteroides的增加，并在6-Hz惊厥模型中介导了KD的保护作用。
图3.KD相关细菌充分介导其抗癫痫作用
3、肠道微生物群可以防止CD的小鼠的癫痫发作
先前的实验研究了KD的惊厥保护作用。为了确定KD相关的肠道微生物是否也会对喂食CD的小鼠产生抗癫痫作用，Abx处理的小鼠分布被移植CD/KD小鼠的粪便，分别给予CD/KD饮食治疗4天后测试其对6 Hz惊厥的易感性。在移植CD小鼠粪便后，小鼠的惊厥阈值增加（图4.A），这与KD的癫痫保护的能力是一致的；重要的是，移植KD小鼠的肠道菌群提高喂食CD小鼠的惊厥阈值，这表明肠道菌群即使在CD小鼠身上也能提供癫痫保护。与单独移植Parabacteroides, A. muciniphila, 或B. longum 相比在Abx小鼠CD喂养并富集A. muciniphila 和Parabacteroides 可表现出抗癫痫作用（图4.B）。
然而，与SPF-CD对照组相比，A bx的SPF CD小鼠和GF-CD小鼠的惊厥阈值升高使有点难以解释。为了阐明这种不确定性，他们研究了外源性（SPF-CD 小鼠每天用h 109CFU A灌胃28天）给予A. muciniphila 及Parabacteroides 是否具有抗癫痫作用，结果表明这种方式仍可提高惊厥阈值（图4.C）；此外，与对照组相比，热杀菌治疗可降低癫痫发作阈值，表明有活力的细菌对产生抗癫痫作用及释放促进对6-Hz癫痫发作敏感性的细菌细胞表面或细胞内因子是必要的，另一方面停止治疗21天后丧失了升高发作阈值的作用，仅治疗4天的小鼠没有观察到癫痫的保护作用（图4.D），这表明长期暴露是必需的。综述所述，KD相关微生物粪便移植及长期KD相关菌群A. muciniphila 和Parabacteroides的治疗可对CD小鼠产生癫痫保护作用。
图4.KD相关细菌对饮食控制的小鼠的癫痫保护作用
4、KD相关菌群减少Kcna 1-/-小鼠的强直性阵挛发作
为了确定6-Hz模型上的结果是否也适用于不同的发作类型和病因，他们进一步测试了肠道菌群在颞叶癫痫与癫痫猝死（Sudden Unexpected Death in Epilepsy ，SUDEP）的Kcna 1-/-小鼠模型中调节全身强直阵挛发作的作用，Kcna 1-/-小鼠在电压门控钾通道Kv1.1 α亚基中有一个null突变，模拟人类KCNA1基因突变与癫痫、共济失调及SUDEP的关联。据报道KD可减少54%的Kcna 1-/-小鼠导致的严重的自发性反复发作。Kcna 1-/-SPF C3HeB/FeJ 小鼠Abx或空白处理1周，然后分别灌胃给予空白或A. muciniphila &Parabacteroides并行KD/CD喂养3周；随后据EEG识别癫痫发作并记录小鼠3天内的发作频率及持续时间（图5.C）。与6-Hz模型的结果一致，KD-Kcna 1-/-小鼠体内A. muciniphila 和Parabacteroides 的丰度显著升高（图5.A&B），但富集程度略低于6-Hz模型，这可能是由于宿主基因型对基本微生物区系组成和KD的响应差异所致，尽管如此，KD-Kcna 1-/-小鼠的癫痫发作频率和持续时间均显著低于CD-Kcna 1-/-小鼠（图5.D）。
有趣的是在KD-Kcna 1-/-组中Abx预处理有升高小鼠的每日发作次数及总发作持续时间的趋势，尽管无显着性差异（图S5.A-S5.D），表明Abx预处理（肠道菌群耗竭）的初步效果是针对对癫痫自发发作的影响而不是癫痫发作形式（图S5.A）。此外，在Abx-Kcna 1-/-小鼠体内定植A. muciniphila 和Parabacteroides 减少了癫痫发作频率和持续时间，使其与对照组水平持平（图5.D）.KD与CD小鼠的体重及食物消耗量均无显着性差异（图S5.E）。与先前使用了不同KD配方报道的结果（Simeone et al., 2016）不同，他们观察到各组间的存活率没有差异（图S5.F）。
综上所述，这些发现支持了这一观点，即肠道微生物在不同的癫痫发作类型和小鼠模型中均可介导KD的抗癫痫作用。
图5.KD相关菌群KD-Associated Bacteria 调节KD对强直性阵挛发作的保护作用
图S5. KCNA1 Mouse Line的癫痫发作形式，体重，食物消耗及存活率
5、肠道菌群调节肠道、血清及脑代谢
基于肠道菌群在调节KD治疗癫痫的作用，他们假设微生物膳食代谢可调节影响癫痫易感性的次级代谢，他们利用代谢组学分析鉴定CD-SPF小鼠，KD-SPF小鼠、Abx处理的KD-SPF小鼠以及A. muciniphila 和Parabacteroides 富集的KD小鼠结肠腔内容物和血清中的候选微生物依赖性分子。在小鼠结肠中检测到622种代谢产物，包括氨基酸、碳水化合物、脂质、核苷酸、肽和异生物超群（xenobiotic supergroups）；在小鼠血清中检测到670种代谢物。结肠内容物和血清中代谢组分检出保护组与易感组，预测准确率分别为94%和87.5%（图6.B）。有趣的是，大多数起重要作用的代谢产物都与氨基酸代谢有关，包括赖氨酸、酪氨酸和苏氨酸的衍生物。此外与惊厥易感组相比，生酮源性γ-谷氨酰化氨基酸-γ-谷氨酰（GG）-亮氨酸、GG-赖氨酸、GG-苏氨酸、GG-色氨酸、GG-酪氨酸在结肠内容物及血清中均下降，与未修饰的氨基酸相比，γ-谷氨酰化修饰的氨基酸尤其受到影响（图6.C&D）。这表明肠道微生物对γ-谷氨酰化本身具有调节作用或对酮源性GG-氨基酸的具有选择性代谢，且酮源性GG-氨基酸与癫痫易感性相关。总的来说，这些发现表明肠道微生物区系对KD的肠道和全身代谢反应有调节作用，并进一步揭示了KD诱导的癫痫保护与微生物群依赖性GG-氨基酸水平的改变之间的联系。
大脑依靠必需氨基酸的主动转运来促进神经递质的生物合成，因此，对外周氨基酸生物利用度的波动很敏感，外周氨基酸是GABA和谷氨酸合成的底物。有报道显示特别GG-氨基酸与非GG-氨基酸相比，表现出更多的运输特性，他们揭示了饮食和微生物依赖的血清酮源性氨基酸的变化，氨基酸转运与脑GABA水平之间的联系，目前的理论认为GABA有助于KD的抗癫痫作用的理论。本文检测了小鼠海马（一个对癫痫活动的传播很重要的大脑区域）中GABA和谷氨酸的游离水平，海马代谢物谱可区分癫痫保护小鼠和癫痫易感小鼠（图6.E）。在饮食和微生物体介导的癫痫发作保护组中，GABA和谷氨酸的水平都会增加，而GABA比谷氨酸的水平要高得多（图6.G），与此相一致，KD-SPF小鼠海马GABA/谷氨酸比值显著高于CD对照组（图6.F）。这些变化在Abx处理后消失，但富集A. muciniphila和Parabacteroides后重新恢复，海马中的谷氨酰胺（谷氨酸和GABA的底物）出现类似的变化。
总的来说，这些结果揭示了小鼠的海马GABA和谷氨酸水平受到饮食和微生物依赖性的调节。
图6.外周γ-谷氨酰氨基酸的减少和海马GABA/谷氨酸比值的增加与饮食和微生物依赖的癫痫保护有关。
6、细菌GGT活性对癫痫易感性的影响
氨基酸的γ-谷氨酰化形式是由谷胱甘肽的GG部分转移至氨基酸而成的，为了确定氨基酸的γ-谷氨酰化是否影响癫痫易感性，他们将CD-SPF小鼠灌胃给予选择性的不可逆γ-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyltranspeptidase，GGT）抑制剂3天。用GGT抑制剂治疗的SPF-CD小鼠表现出6-Hz惊厥阈值增加，趋于KD-SPF 小鼠的水平（图7.A）；同样，CD-SPF的Kcna1-/-小鼠的脑电图记录显示，每次发作的平均持续时间明显减少（图S5.G）。这表明外周抑制γ-谷氨酰化和限制GG-氨基酸可促进癫痫保护作用，与癫痫易感组相比，结肠腔内容物和血清中的酮源性GG-氨基酸同步减少。
进一步为了确定是氨基酸谷氨酰化的抑制，而非谷胱甘肽的分解代谢为KD微生物区系的抗癫痫作用所必需的，他们对KD小鼠饮食中添加了生酮氨基酸亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸，并测试了6-Hz惊厥阈值。结果表明，提高小鼠体内的生酮氨基酸水平可以将发作阈值降低，趋近到CD-SPF对照组的水平（图7.B），这表明限制外周的生酮氨基酸对于KD介导的抗癫痫作用是必需的。一般来说，宿主细胞和特定细菌均表现出GGT活性，为了深入了解A. muciniphila和Parabacteroides的体内相互作用是否抑制细菌的γ-谷氨酰化，他们进一步测定了SPF或A. muciniphila和Parabacteroides富集的CD/KD小鼠的的粪便样品中GGT的活性，与CD-SPF小鼠相比，KD-SPF小鼠粪便GGT活性降低（图7.C）。在A. muciniphila和Parabacteroides富集喂养的小鼠中，粪便中GGT活性也有类似的下降。此外与SPF小鼠相比，富集A. muciniphila和Parabacteroides并KD喂养进一步降低了小鼠粪便中GGT的活性，这与KD-SPF 及CD-SPF小鼠粪便GGT活性相比有显着性差异（P<0.05）。将所有粪便样本暴露于GGT抑制剂中检测到的结果消失，进一步证实了GGT活性的重要性；与此相一致的是，与对照组相比，用A. muciniphila和Parabacteroides处理的CD-SPF小鼠和热杀菌处理的小鼠体内粪便GGT活性均降低（图7.D）。
综上，这些数据表明，富集或外源性给予A. muciniphila和Parabacteroides治疗会降低粪便的GGT活性，这可能可以解释在癫痫保护组小鼠结肠内容物和血清中观察到的较低水平的GG-氨基酸水平。
为了深入探讨细菌γ-谷氨酰化是否受到A. muciniphila和Parabacteroides的相互作用的影响，本文进行了体外交叉饲养实验，并测定了细菌中GGT的活性。结果表明A. muciniphila并不具有GGT活性，而Parabacteroides的GGT活性被GGT抑制剂清除（图8.A）。.当A. muciniphila载入入CD或KD琼脂中，Parabacteroides覆盖在M9培养基上时，这两种细菌的生长都会增强（图7.E&F），表明A. muciniphila能释放可溶性因子促进Parabacteroides的生长，Parabacteroides反过来又增强A. muciniphila的生长，这种相互作用可以促进两者在KD小鼠体内的内源性富集（图1.F）。有趣的是，A. muciniphila在M9培养基中的生长不受KD或CD琼脂包埋的Parabacteroides的影响，说明A. muciniphila不能依靠Parabacteroides交叉喂养而存活；此外在CD或KD琼脂中加入A. muciniphila可消除Parabacteroides自身的高GGT活性（图7.G&H），这与KD相关细菌在体内富集后的粪便中GGT活性和GG-氨基酸水平的下降相一致。为了确定Parabacteroides的GGT活性的降低是否影响A. muciniphila的生长，他们在交叉喂饲试验前将空白对照或GGT抑制剂对Parabacteroides进行预处理，结果与对照组相比，A. muciniphila暴露在GGT抑制剂预处理的Parabacteroides中在24小时有明显的生长（图8.B）。
综上所述，这些发现表明A. muciniphila能够代谢KD和CD饲料中的组分来支持Parabacteroides的生长，这种协同作用降低了GGT的活性，反过来，Parabacteroides的活性降低促进了A. muciniphila的生长。这与他们的研究结果相一致，即KD增加了A. muciniphila和Parabacteroides的肠道相对丰度，而A. muciniphila和Parabacteroides的富集降低了粪便中GGT活性、结肠内容物和血清中GG-氨基酸水平。
图7.生酮饮食和细菌交叉喂养可以降低γ-谷氨酰转肽酶的活性，GGT抑制剂能有效地控制癫痫发作。
图8.氨基酸对细菌GGT活性的影响
微生物在宿主的消化、代谢和行为中起着关键的作用，但是微生物对饮食的反应是否也会影响神经元的活动尚不清楚。本文证明KD喂养改变了两种癫痫小鼠模型的肠道微生物群，而微生物学的改变对于给予癫痫的保护是必要的和足够的。一些临床研究将抗生素治疗与癫痫发作风险的增加联系起来：长期使用甲硝唑可引起惊厥，氨苄西林暴露与癫痫发作风险升高有关。盘尼西林和其他β-内酰胺类药物被认为可以直接降低GABA能抑制作用，但微生物群的减少是否导致癫痫发作频率的增加尚不清楚。而本文的研究结果表明，在野生型和Kcna1-/-小鼠中，通过大剂量抗生素治疗后微生物群的减少会增加癫痫风险和对KD的响应，这些抗生素产生的效果在肠道细菌重新定后消除，这表明抗生素的使用和人类的癫痫发作之间的联系可以由微生物介导。
总之，这项研究的结果表明KD改变了肠道微生物群，促进选择性微生物的相互作用，降低细菌γ-谷氨酰化活性，从而降低外周GG-氨基酸水平，提高海马中GABA/谷氨酸的比值，产生抗癫痫作用（图9）。在临床上确定人类癫痫是否与微生物失调有关，以及癫痫患者暴露抗生素是否会影响对KD治疗的反应是有必要的。
图9.实验总结