Nat. Rev. Genet. | 临床中的宏基因组学（IF: 41.465）
美国加州大学旧金山分校Charles Y. Chiu和Steven A. Miller 于2019年3月27日在《Nature Reviews Genetics》上发表题目为《Clinical metagenomics》的综述。该综述回顾了目前宏基因组学在临床和公共卫生环境中的各种应用。讨论了在临床实验室中采用宏基因组学所涉及的挑战，包括超出其在研究实验室最初开发的验证和监管考虑因素，并提出了克服这些挑战的步骤。最后，设想了临床宏基因组学领域的未来发展方向，并预测未来5年将会实现的目标。
文章摘要
临床宏基因组新一代测序（mNGS），来自患者样本的微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）的综合分析，正在迅速从研究实验室转移到临床实验室。这种新兴方法正在改变医生诊断和治疗传染病的方式，其应用范围涉及广泛的领域，包括抗菌素耐药性，微生物组，人类宿主基因表达（转录组学）和肿瘤学。在这里，我们专注于在临床实验室中实施mNGS的挑战，并解决可能最大化其对患者护理和公共健康影响的潜在解决方案。
文中主要图片说明
图1 | 宏基因组测序的临床应用。
A | 在传染病诊断中的应用包括直接鉴定来自初级临床样品的微生物（图Aa）;通过表征抗性基因预测抗菌素抗性（图Ab）;检测菌种水平或菌株水平的毒力决定因素，如特定内毒素或外毒素的分泌（图Ac）; 和抗病毒抗性预测（部分Ad）。如HIV-1所示，通过宏基因组下一代测序（mNGS）（部分Ad，图）从患者样品中回收完整的病毒基因组有助于序列分析以预测对抗逆转录病毒药物的易感性或抗性（部分Ad，条形图）;分析菌株的易感性特征（黑条）可预测对非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI）类药物（用星号表示）的抗性，其与核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）或蛋白酶抑制剂（PIs）相反。
B |微生物组分析可以为急性和慢性疾病状态的疾病预后提供信息，并为益生菌治疗的发展奠定基础。彩色条代表单个微生物菌种。生态失调（一种不健康的状态）常表现为物种多样性的减少，例如在艰难梭菌相关疾病的患者。可以通过移植来自健康个体的粪便或作为粪便丸口服给药以治疗患有艰难梭菌感染的患者。或者，由在健康个体中观察到的微生物菌种所合成的粪便可用作治疗患者的益生菌。除了艰难梭菌感染之外，诸如肥胖症，炎性肠病和糖尿病等慢性疾病是益生菌治疗的潜在靶标。
c | 基于RNA测序的转录组学可以基于人类宿主反应来改善感染性和非感染性疾病的诊断。NGS的宿主转录组学分析可以构建分类器度量以准确区分未感染患者（蓝色条）和感染患者（红色条）（图ca）。虚线上方的度量分数表示感染，而虚线下方的分数表示没有感染;显示的分类器指标的总体准确度为83％。聚类热图分析可鉴定感染患者（基因A-F）和未感染患者（基因G-L）的宿主基因的表达差异（图cb）。
D | 肿瘤学中的病毒肿瘤测序或液体活检分析可用于同时病原体检测和表征宿主基因突变。mNGS可用于检测Merkel细胞多瘤病毒，这种病毒与Merkel细胞癌的发展有关。宿主DNA的同时测序可以识别由含有全长大T抗原（LT）的病毒基因组的整合引起的突变，随后在LT病毒基因组整合之前截短LT抗原（部分Da）或截短LT抗原（图Db）。这两种突变都导致细胞转化，从而驱动肿瘤增殖。虽然很有希望，但许多这些基于测序的应用尚未纳入常规临床实践中。
图2 | 靶向与非靶向霰弹枪宏基因组下一代测序方法。
可以使用靶向或非靶向宏基因组新一代测序（mNGS）方法分析多种患者样品以及培养的微生物菌落，用于病原体鉴定，微生物组分析和/或宿主转录组分析。Universal PCR（左）是一种靶向mNGS方法，使用从保守区域设计的引物，例如在细菌（16S或23S rRNA）或真菌和寄生虫（18S rRNA，28S rRNA或内部转录间隔区（ITS））中普遍保守的核糖体RNA（rRNA）基因。可以设计其他组引物以靶向一组确定的病原体和/或基因，并用于多重逆转录PCR或PCR（多重扩增子PCR）。NGS文库制备和所得扩增子的测序使得病原体识别能够进入属或种水平。宏基因组测序（右）需要对临床样品中存在的所有微生物和宿主核酸进行无偏径的鸟枪测序。构建单独的DNA和RNA文库;DNA文库用于鉴定细菌，真菌，DNA病毒和寄生虫，而RNA文库用于鉴定RNA病毒和基于RNA测序的人宿主转录组谱（热图，右下图）。由于在无偏的mNGS中没有使用引物或探针，绝大多数读数对应于人宿主，因此，从宏基因组文库中检测病原体是“大海捞针”的努力。使用磁珠的任选捕获探针富集步骤使得能够靶向来自宏基因组文库的病原体和/或基因的mNGS。所有这些方法都与传统台式仪器上的测序兼容，例如Illumina HiSeq和便携式纳米孔测序仪，例如Oxford Nanopore Technologies MinION。
图3 | 在临床环境中常规部署宏基因组测序的挑战。
在该过程的每个步骤中，实施用于诊断感染的临床宏基因组管道时必须考虑多个因素（要点），以最大化准确性和临床相关性。特别是，作为临床微生物测序板的一部分，在临床环境中解释和讨论宏基因组下一代测序（mNGS）测试的结果通常是有用的，类似于肿瘤学中的肿瘤板。EMR，电子病历。
图4 | 典型的宏基因组下一代测序生物信息学管道。
通常为FASTQ或序列对比（SAM）格式的下一代测序（NGS）数据集在计算服务器，便携式膝上型或台式计算机上或在云上进行分析。初始预处理步骤包括低质量滤波，低复杂度滤波和适配器微调。通过将读数映射到宿主（例如，人）基因组并将宿主读数放在一边用于随后的转录组（RNA）或基因组（DNA）分析来进行计算宿主减法。剩余的未映射的读数直接与大型参考数据库对齐，例如国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库或微生物参考序列或基因组集合，或者首先从头组装成更长的连续序列（重叠群），然后对齐到参考数据库。在分类学分类后，其中将个体读数或重叠群分配到特定的分类群（例如，物种，属和家族）中，可以以多种不同的形式分析和可视化数据。这些包括覆盖图和成对同一性图，以确定已回收了多少微生物基因组及其与数据库中参考基因组的相似性;克朗描绘了宏基因组图书馆中的分类多样性;系统发育分析，比较组装基因，基因区域或基因组与参考序列;和热图显示在临床样本中检测到的微生物。
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