【技术篇】微生物检验方法-食品中生物素的检验
食品微生物检测
生物素又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。
是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。当缺乏生物素时，易引起头皮屑增多，掉发，少年白头，皮肤炎等症状。婴幼儿缺乏生物素，易造成生长发育受阻，骨骼生长不良。
人体必须的大多数维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得。生物素也是如此。所以我们要检验食品中生物素的含量，保证人体摄入量能满足身体需求。
食品中生物素的测定：GB 5009.259-2016《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》
本标准规定了食品中生物素的测定方法，适用于食品中生物素的测定。
2.1 检验环境要求
生物素测定工作在一级生物安全实验室进行即可。由于生物素涉及的菌株是无害的植物乳杆菌，所以无需在二级生物安全实验室内进行。样品检验时注意不同样品间器具分开，避免交叉污染。同时由于维生素测定试验的敏感性，所以要特别防止环境对样品和操作过程的污染。
2.2 检验人员要求
检验人员应具备生物安全上岗证，压力容器上岗证，微生物检验人员上岗证。进入洁净工作区前，检验人员需要二次更衣，佩戴帽子、口罩、一次性无菌手套，换鞋。
2.3 检验设备要求
使用仪器需要定期进行检定/校准，每次使用仪器前需填写使用记录，开生物安全柜，紫外线照射30分钟，酒精消毒台面。
2.4 检验用培养基
检验用培养基均应符合GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》。按生物素测定国标规定，选用乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基、生物素测定培养基。
2.5 生物垃圾的处理
所有生物垃圾应经121℃高压灭菌20min后，方可运离实验室，并按医疗废弃物处理。
3.1 实验前处理
3.1.1 实验前玻璃器皿的处理
使用前将玻璃器皿进行洗刷。用活性剂，如月桂基磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可，对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后200℃干热2h后方可使用。
3.1.2 实验前样品的处理
3.1.3 试验试剂的配制
生物素测定试验会用到很多试剂均需要提前准备，包括50%乙醇溶液、0.5mol/L氢氧化钠溶液、0.85%氯化钠溶液、1mol/L盐酸溶液、柠檬酸盐缓冲液（pH4.5）、蛋白酶-淀粉酶液、3%硫酸溶液。这些试剂按照国标上的要求和成分自行配制即可，其中蛋白酶-淀粉酶液需要现配现用。
3.1.3 实验前培养基配制
培养基可购买商品化脱水合成培养基，也可以购买培养基成分自行配制。生物素测定的3种培养基分别是：乳酸杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌肉汤培养基和生物素测定用培养基。前两种都涉及标准菌种活化，所以需要提前配制。用天平称取一定量干粉培养基，加入适量番茄汁和蒸馏水，电炉/微波炉煮沸，分装试管，121℃高压灭菌15min，备用。乳酸杆菌琼脂培养基需摆成斜面。
3.2 标准溶液的配制
3.2.1 配制生物素标准储备液
浓度100μg/mL，标准品要求纯度≥99%。用天平称取100mg 生物素标准品，置于烧杯中，用50%乙醇溶液溶解后转移至1000mL称量瓶中，烧杯用50%乙醇溶液清洗三次，清洗液均加入容量瓶，避免烧杯中有生物素残留，定容至刻度。可存储于棕色瓶中，于2-4℃冰箱保存12个月。
3.2.2 配制生物素标准中间液
生物素标准中间液浓度1.0μg/mL，准确吸取1mL生物素标准储备液置于100mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀后储存于瓶中2-4℃冰箱，可保存6个月。
3.2.3 配制生物素标准工作液
生物素标准工作液浓度10.0ng/mL，准确吸取1mL生物素标准中间液置于100mL棕色容量瓶中，用水稀释，定容至刻度，混匀，临用前现配。
3.2.4 配制标准使用工作液
生物素标准使用工作液，高浓度溶液为0.2ng/mL和低浓度溶液为0.1ng/mL。从标准工作液中吸取两次各5mL，分别加入一个250mL容量瓶和一个500mL容量瓶，分别用水定容到250mL和500mL即可。
3.3 菌种的制备与保存
3.3.1 储备菌种的制备
将标准菌种植物乳杆菌（菌号：ATCC8014）划线接种至乳酸杆菌琼脂培养基斜面上，在37±1℃恒温培养箱中培养20-24h，之后放入2-4℃冰箱作为储备菌株保存，每月至少传代一次。实验前将储备菌种从冰箱取出，接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，于37±1℃恒温培养箱中培养20-24h以活化菌株，准备用于接种液的制备。如果储备菌株在冰箱保存时间达数周以上，不能立刻接种用于接种液制备，需要连续传2-3代保证菌活力回复后，再进行接种液制备。
3.3.2 接种液的制备
用接种环将活化的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，于37±1℃恒温培养箱中培养16-20h，取出后将菌悬液离心，弃去上清液，再用0.85%氯化钠溶液振匀并离心，弃去上清液，如此三次。最后用0.85%氯化钠溶液稀释至透光率80%。
3.4 样品测定
3.4.1 试样提取
此法适用于包含原生和添加生物素的样品提取。例如婴幼儿配方食品、谷物类等制品。准确称取适量试样（m），约含0.2～0.5μg生物素，精确至0.001g。以婴幼儿配方奶粉为例，可以根据添加量计算称样量和稀释倍数，最终把浓度控制在0.01～0.1ng/mL范围内。
称一定量样品至一个250mL锥形瓶中，加100mL硫酸溶液，于121℃高压水解30min，试样取出后冷却。用氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.2，转到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用滤纸过滤，弃去最初的几毫升。吸取滤液5mL，加入约20mL水，用氢氧化钠溶液调节pH为6.8±0.2。转至100mL容量瓶中，用水定容至刻度。所以样品的称量数取决于对样品中生物含量的预估，使最终试样稀释后生物素浓度控制在0.01～0.1ng/mL范围内即可。
3.4.2 质控
准确称取适量已知浓度的标样，约含0.2～0.5μg生物素，精确值0.001g，后续处理方法同样品。
3.4.3 加标回收
准确称取适量试样，约含0.2～0.5μg生物素，精确值0.001g，加入含等量生物素的标准溶液，后续处理方法同样品。
3.4.5 试样稀释
如果需要，进行适度稀释，使试样稀释液中生物素含量最终控制在0.01～0.1ng/mL范围内。
3.4.6 测定系列管制备
取四支试管，分别加入1ml、2ml、2ml、4ml试样提取液，即为Vx，补水至5mL。加入5mL生物素测定用培养液，混匀，每个梯度做3个平行。如表1所示。
3.4.7 标准系列管制备
如表2所示。取试管分别加入生物素标准工作溶液、水和培养液，混匀，每个梯度做3个平行。绘制标准曲线时，以每点平均值计算。
将上述试管盖上试管帽，包括标准系列管和试样系列管，于121℃高压灭菌5min，取出快速冷却至室温，备用。
3.4.8 培养
在无菌条件下，用移液器或无菌针管向每只测定管接种1滴接种液，其中标准曲线管中未接种空白和样品空白不接种。置于37±1℃恒温培养箱中培养19-20h，直至获得最大浑浊度，即在培养两小时透光率无明显变化。
3.4.9 测定
将培养好的测定管用涡漩混匀器混匀。用厚度为1cm的比色杯，于550nm处，以接种空白管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管和试样系列管的吸光度值。如果未接种空白对照有明显的细菌增长，说明可能有杂菌混入，需重做试验。
3.5 结果分析
3.5.1 绘制标准曲线
以标准系列管生物素含量为横坐标，每个标准点吸光度值均值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.5.2 样液结果计算
从标准曲线上的公式计算出试样系列管中生物素的相应含量Cx。如果每个试样的3个测试管中有2个值落在0.01ng～0.1ng范围内，且每个测试管之间吸光值偏差小于10%，则按式（1），式（2）进行结果计算。
3 生物素检验系统成立
3.1 质控标样的检测结果应符合说明书给出的检测范围；
3.2 加标回收率在90%～110%；
3.3 在重复性条件下获得的两次独立的测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
3.4 线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg/L-mg/L、μg/mL-μg/mL等表示。
检出限是方法能检出某物质时的最低浓度。
定量限是方法能准确定量出某物质时的最低浓度。
本方法线性范围为0.01μg/mL-0.1μg/mL，检出限为2.0μg/100g，定量限为4.0μg/100g
1 试验玻璃器皿专用。微生物法测定维生素的要求较高，所以实验室所有玻璃器皿要与其他微生物试验区分开。注意所有玻璃器皿要仔细清洗。
2 整个试验操作要避免微生物污染和外来生物素污染，所以操作要格外注意。
3 保证标准菌株活力。标准菌的活力对试验结果影响很大，一定要按标准规定对标准菌株进行传代，保证活力。
4 把握好培养终止时间。要密切监测最高浓度试管的浑浊度，一旦出现最大混浊度要立刻终止培养开始测定吸光度。
5 稀释定容一定要准确。标准品和试样都会进行高倍数稀释，所以一定要准确，避免误差过大。