科研 | Semin. Cancer Biol.：肉瘤的蛋白组学研究-现状和机遇（上）
编译：伊安，编辑：小白、江舜尧。
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肉瘤是一组具有70多个组织学亚型的间充质恶性肿瘤。目前大多数肉瘤发生发展的分子机制尚未明确，这阻碍了肉瘤的临床治疗和预后发展。迄今为止，蛋白组学技术已广泛应用到了肉瘤研究领域。目前蛋白组学研究的重点主要集中在组织学亚型上，这包括对肉瘤的生物学特性的研究，以及鉴定出用于临床诊断、预测和预后的候选标志物等，该领域还处于起步阶段，其蛋白组学研究结果尚未转化为临床应用。在这篇评论中作者对几种罕见和超罕见肉瘤组织学亚型的蛋白组学研究进行详细地阐述，这些亚型包括胃肠道间质瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性横纹肌瘤、尤文肉瘤、粘液性纤维肉瘤和肺泡软组织肉瘤。同时，将蛋白组学与其它分子数据结合，探讨蛋白组学在临床实验中的应用，以期促进对这类复杂罕见癌症的生物学特性的了解和临床研究。
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内容
1. 背景
软组织（(STSs)）或原发性骨肉瘤是由多能间充质干细胞恶性转化而来的罕见肿瘤，肉瘤约占所有肿瘤的1%，而原发恶性骨肿瘤约占肉瘤的10%。尽管肉瘤的细胞来源相同，但它却是一组具有不同的病理和遗传畸变的异质性癌症，有70种以上不同的组织学亚型。这种生物学上的异质性在临床上反映为各亚型在自然病程和治疗反应方面有所不同。因此，软组织和骨肉瘤的诊断可以从惰性和可治愈的肿瘤到具有侵袭性、转移性和复发临床表型的高致命性肿瘤。手术整体切除是局部肉瘤治疗的主要方法，但若因手术切除在解剖学上不具有可行性，如果肿瘤存在转移，就必须进行全身化疗或放疗。虽然尤文肉瘤(ES)和骨肉瘤对化疗敏感，但目前大部分患者对化疗药物表现出明显的耐药性。此外，有效的新疗法受到肉瘤的罕见性和“一刀切”方法的阻碍，同时这种“一刀切”方法导致科研工作者招募具有多种肉瘤亚型的异质性患者进入临床实验。尽管最近对某些软组织肉瘤亚型的靶向疗法已经进行了临床实验阶段，例如治疗肺泡软组织肉瘤的西地尼布，但对于大多数肉瘤亚型的潜在分子驱动因素以及这些因素如何影响治疗尚未明确。因此，由于目前对肉瘤生物学特征的理解不足，以及缺乏治疗肉瘤的有效方法，需要我们对肉瘤进行进一步深入研究。
自人类基因组计划完成以来，我们对癌症相关的遗传因素有了深入了解。相比之下，人类癌症的蛋白组研究在很大程度上仍未得到探索，而且蛋白组学研究相对于丰富的基因组研究来说是有限的。这种基因组-蛋白组学的差异在肉瘤研究中表现得尤为明显，肉瘤蛋白组学研究主要集中在最常见的亚型上，很少有全面的研究。肉瘤蛋白组学研究的缺乏在很大程度上可以归因于疾病的罕见，疾病样本的缺乏以及制药公司对肿瘤药物的开发缺乏兴趣也会限制其发展。尽管存在这些限制，蛋白组学探索罕见疾病的潜力不应被低估。用于评估其他类型的癌症的蛋白组学技术提供了与其基因组对应的互补和对比数据，这有助于推动对疾病的分子机制的理解，例如，识别与癌症相关的增殖和侵袭等，利用基因组、表观基因组和蛋白组学时产生比单个数据类型更稳定的生物标志物。蛋白组学有利于识别新的生物标志物和治疗靶点，这有助于推动对肉瘤分子病理学的研究。蛋白组学研究的目的是通过识别候选生物标志物，来发现对疾病诊断、患者分层、临床预后和病程有价值的关键蛋白。因此，这些研究允许进行未经证实的疾病监测，进而允许进行知情的临床决定；推动临床疗效的改善。此外，蛋白是绝大多数疗法的靶点，因此，识别介导肉瘤进展、转移和耐药的关键蛋白表达或蛋白修饰，可以为肉瘤的治疗提供新的治疗途径。除了直接的临床效应，考虑到蛋白在调节生理和病理过程中的作用，蛋白组学能够为我们提供了重要的生物学见解来改善我们对疾病病因和进展的理解。这种对疾病基本生物学理解的改善最终将为加速这些罕见癌症的新进展奠定坚实的基础(图1)。
在此，我们对肉瘤研究中使用的蛋白组学方法进行了全面的综述，并确定了蛋白组学在罕见和超罕见肉瘤亚型中的研究现状，同时对肉瘤蛋白组学的未来进行了展望，强调了该领域目前的局限性，并提出了如何克服这些挑战来促进研究的迅速发展。
图1 肉瘤研究中使用蛋白组学方法潜在优势
2. 蛋白组学策略综述
蛋白组学除了研究蛋白丰度，还对蛋白的调节和活性进行分析，这有利于推动对单个细胞乃至整个有机体蛋白组学的研究。蛋白组学通过对蛋白异构体、蛋白翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用进行分析能够为蛋白的动态变化提供了详细的数据。目前质谱（MS）和非MS蛋白组学技术已应用于癌症研究，这两种技术有各自的优点和缺点（表1）。
肉瘤研究中的非MS蛋白组学方法大部分是基于微阵列，最常见的是反相蛋白微阵列（RPPA）。RPPA需要将肿瘤组织裂解物固定在微阵列表面，然后用抗体靶向蛋白进行探测，这能够定量评估数百个样品中的蛋白水平。另外也可以进行抗体阵列研究，这种方法涉及固定一组针对某一系列蛋白靶标的抗体，用已裂解的组织样品进行探测，这种方法能够同时评估一个样品中的多种蛋白。使用抗体阵列研究的优势是只需要极少量的样本就能进行蛋白组学研究，这正适合研究样本有限的超罕见肉瘤亚型。虽然非MS蛋白组学已经为对肉瘤研究提供了有价值的新见解，但它们对抗体的依赖性有一定局限。首先，并不是所有的蛋白都有抗体，也不是所有的抗体都是针对目标蛋白，因此想要通过微阵列研究获取数百个以上的蛋白较为困难。此外，微阵列研究还需要对所研究的蛋白进行明确，因此这种方法不能真实、有效的反映蛋白变化。
在这部分我们将简要介绍肉瘤研究中已报道的MS蛋白组学。与非MS蛋白组学相比，MS蛋白组学无偏倚，并且能够进行更敏感和准确的蛋白鉴定，因此，MS衍生的蛋白图谱更加全面。然而，MS蛋白组学的主要局限性仍然存在，最值得注意的是尽管多重等压标记技术已经有所进步，但这些方法的通量仍然很低，因此MS分析不太可能得到微阵列所获得的蛋白通量。
临床蛋白组学通常涉及对复杂生物样品的研究，因此在MS分析之前为了提高它的覆盖率，经常需要在蛋白消化后进行肽段分离。肽段分离的常用方法包括反相液相色谱法、等电聚焦电泳法、强阳离子交换和高pH分馏，这些方法的优缺点已在其他地方详细讨论。在二维差异电泳(2D-DIGE)对肉瘤蛋白组学进行研究时，一般是在蛋白消化前用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）进行蛋白分离，用荧光染料标记2D-DIGE分析的样品，并使用PAGE进行蛋白分离，扫描带有染料标记的二维凝胶来显示样品之间的差异蛋白点，这些蛋白随后在“凝胶内”被消化、提取，并由MS鉴定。
样品分离后，主要使用两种质谱：电喷雾电离(ESI)或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。无论采用何种方法，都可以通过分析进行蛋白鉴定并解释产生的蛋白图谱。为了使用ESI-或MALDI-MS实现蛋白鉴定的高可信度，蛋白组学研究成功的关键也需要准确定量。为了实现这一目标已经建立多种方法，但是在肉瘤蛋白组学研究中最常采用的是无标记定量和等压标记。等压标记包括相对和绝对定量等压标记(iTRAQ)和串联质谱标记(TMT)，在质谱仪中运行不同同位素标签标记的样品，片段诱导的标签裂解后在质谱中生成报告离子，用于对肽和蛋白进行定量。
当前蛋白组学的研究方法能够对不同的样本进行分析，这些样本可以是细胞，也可以是冰冻组织或者福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。鉴于这些样本在生物学、化学和物理学方面的差异，某些蛋白组学更适用于对特定样本类型进行研究。到目前为止，肉瘤的MS蛋白组学研究中使用的绝大多数样本都是来源于冰冻组织或细胞，这在一定程度上反映了冰冻组织和细胞易提取蛋白。相比之下，由于石蜡和福尔马林形成的交联复合物阻碍了蛋白的有效表达，因此从FFPE组织中提取蛋白进行MS蛋白组学分析存在挑战。目前FFPE组织通常用免疫组织化学(IHC)进行分析，通过提供特定蛋白的空间分辨率来弥补蛋白组学研究的不足。